临床样本蛋白组学分析
鉴定结核性胸膜纤维化患者胸膜组织中差异表达的ECM蛋白，发现collagen VII等纤维化相关蛋白的升高。
采用串联质谱标签（TMT）蛋白质组学分析4例TBPF患者和4例对照胸膜组织，通过PCA、GO富集等鉴定差异表达蛋白，并通过Masson染色、IHC、IF、Western blot和RT-qPCR验证collagen VII和collagen I的表达。
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过量的VII型胶原通过增加细胞外基质硬度介导胸膜纤维化
Excessive collagen type VII mediates pleural fibrosis via increasing extracellular matrix stiffness
实验完整度
高包含患者样本蛋白组学、细胞模型、基因敲除小鼠模型及功能与机制验证（如siRNA、重组蛋白、底物硬度实验、RNA-Seq、ChIP），证据层级独立且完整。
主要模型
结核性胸膜纤维化患者胸膜组织 原代人间皮细胞（HPMCs） 原代大鼠间皮细胞（PMCs） Wt1-Cre+ Col7a1fl/fl条件敲除小鼠
重点核对
患者与对照胸膜组织中collagen VII表达差异 BLM或TBPE处理PMCs后collagen VII、collagen I和α-SMA的表达时序 Wt1-Cre+ Col7a1fl/fl小鼠中collagen VII敲除效率及对纤维化的影响 ECM硬度对collagen I和α-SMA表达的影响（聚丙烯酰胺水凝胶1、10、30、50 kPa） 整合素抑制剂cilengitide对BLM、TBPE及重组collagen VII诱导的胶原表达的影响
摘要
细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用已被认识到在纤维化疾病的机制中发挥作用。VII型胶原（collagen VII）是一种ECM成分，在细胞-ECM相互作用中发挥重要作用，特别是在细胞锚定和维持ECM完整性方面。胸膜间皮细胞（PMCs）在胸膜中驱动炎症反应和ECM产生。然而，collagen VII和PMCs在胸膜纤维化中的作用此前知之甚少。本研究发现，结核性胸膜纤维化患者胸膜中collagen VII蛋白增加。细胞和动物模型研究表明，collagen VII在胸膜纤维化过程的早期阶段开始增加。在PMCs和动物模型胸膜中，collagen VII的增加早于collagen I和α-SMA。通过间皮细胞特异性敲除collagen VII基因（Wt1-Cre+ Col7a1fl/fl）抑制collagen VII可减轻小鼠实验性胸膜纤维化。最后，发现过量的collagen VII改变胶原构象，导致ECM硬度升高。ECM硬度升高激活整合素/PI3K-AKT/JUN信号通路，促进更多ECM沉积，并介导胸膜纤维化。总之，过量的collagen VII通过增加ECM硬度介导胸膜纤维化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- VII型胶原在胸膜纤维化中的动态变化及其作用机制是什么？
- 核心机制
- 过量的collagen VII改变胶原I的构象（松弛三螺旋结构甚至线性化），增加ECM硬度，进而激活整合素/PI3K-AKT/JUN信号通路，促进ECM沉积和胸膜纤维化。
- 主要证据
- 患者胸膜蛋白组学显示collagen VII升高；细胞和动物模型显示collagen VII早于collagen I和α-SMA升高；间皮细胞特异性敲除collagen VII减轻纤维化；ECM硬度实验、整合素抑制及RNA-Seq和ChIP实验证实下游信号。
- 研究意义
- 揭示collagen VII在胸膜纤维化中的新机制，提示其可能成为胸膜纤维化治疗的潜在靶点，并可能对特发性肺纤维化的发病机制研究有参考价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞和动物模型动态表达分析
在细胞和动物模型中研究collagen VII在胸膜纤维化过程中的动态变化及其与collagen I和α-SMA的比较。
建立BLM加碳颗粒诱导的小鼠胸膜纤维化模型，在不同时间点（3、7、14、21天）检测collagen VII、collagen I和α-SMA的表达；体外用BLM或TBPE处理原代大鼠和人间皮细胞，观察collagen VII、collagen I和α-SMA的表达变化。
胶原VII功能抑制实验
验证抑制collagen VII是否减轻实验性胸膜纤维化。
在细胞中用Col7a1 siRNA敲低collagen VII，观察对BLM或TBPE诱导的collagen I和α-SMA表达的影响；在小鼠中用间皮细胞特异性敲除Col7a1（Wt1-Cre+ Col7a1fl/fl），在BCG、TBPE或BLM加碳颗粒诱导的纤维化模型中评估纤维化程度（Masson染色、IHC、IF、Sirius Red染色、肺功能检测）。
ECM硬度和胶原构象研究
探究collagen VII是否通过改变胶原构象增加ECM硬度。
使用纳米压痕仪测量细胞和组织硬度；通过免疫荧光观察collagen VII与collagen I的共定位；体外用重组collagen VII处理collagen I凝胶，通过扫描电镜观察胶原构象变化，并测量凝胶硬度；在动物模型中观察胶原纤维线性化。
整合素及下游信号通路验证
验证collagen VII通过整合素/PI3K-AKT/JUN信号通路介导胸膜纤维化。
在细胞和动物模型中使用整合素抑制剂cilengitide或Itgav siRNA，观察对collagen I和α-SMA表达及纤维化的影响；通过RNA-Seq和KEGG分析鉴定下游通路为PI3K-AKT；在PMCs中激活或抑制该通路，检测信号蛋白变化；通过ChIP和双荧光素酶报告基因验证JUN对Col1a1和Col7a1的转录调控。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白组学 | Proteome Discoverer/MaxQuant | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物模型构建 | CRISPR/Cas9系统 | Cyagen Biosciences | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞处理 | 博来霉素 | Haerbin Laibotong Pharmaceutical Co. Ltd. | -- |
| 重组人VII型胶原 | Abmart | CG424928S | |
| 重组人TGF-β1蛋白 | R&D Systems | -- | |
| 西仑吉肽 | MedChemExpress | -- | |
| LY294002 | R&D Systems | -- | |
| 碳颗粒 | Mitsubishi Chemical Corp. | -- | |
| Western blot | 抗VII型胶原抗体 | Abcam | ab309143 |
| 抗VII型胶原抗体 | Proteintech | 19799-1-AP | |
| 抗I型胶原抗体 | Affinity | AF7001 | |
| 抗α-SMA抗体 | Bioswamp | PAB59619 | |
| 抗TGF-β1抗体 | Proteintech | 21898-1-AP | |
| 抗PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4249 | |
| 抗p-PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4228 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗p-AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗WT1抗体 | Abcam | ab89901 | |
| 抗JUN抗体 | Proteintech | 24909-1-AP | |
| 抗ITGAV抗体 | Proteintech | 27096-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1 | |
| 抗H3抗体 | Abmart | T56587 | |
| IgG抗体 | Proteintech | 10283-1-AP | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Active Motif | -- |
| ChIP-IT Express酶试剂盒 | Active Motif | 53009 | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因试剂盒 | Vazyme | -- |
| 细胞培养 | 动物上皮细胞培养基 | ScienCell | 4101 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Gibco | -- | |
| 细胞冻存液 | NEST Biotechnology | 211072 | |
| 动物模型 | 卡介苗 | -- | -- |
| 细胞处理 | 结核性胸腔积液 | -- | -- |
| 漏出性胸腔积液 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 表皮生长因子 | -- | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| 蛋白检测 | 蛋白上样缓冲液 | Biolinkedin | L-7102 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| Hiscript Q RT SuperMix | Nanjing Novazyme | -- | |
| Cham Q SYBR qPCR Master Mix | Nanjing Novazyme | -- | |
| RNA-seq | RNA Nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA文库制备试剂盒 | Yeasen Biotechnology | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Neofect转染试剂 | Neofect Biotechnologies | TF201201 | |
| siRNA | VII型胶原siRNA | Ambion | -- |
| Itgav siRNA | -- | -- | |
| Jun siRNA | -- | -- | |
| 力学测定 | Piuma纳米压痕仪 | Optics11 | -- |
| Chiaro纳米压痕仪 | Optics11 | -- | |
| Data Viewer v2.5.0 | Optics11 | -- | |
| 底物制备 | PDMS (Sylgard 184) | Dow Corning | -- |
| 肺功能 | 强制呼吸系统 (CRFM100) | EMMS | -- |
| 全身体积描记法 | EMMS | -- | |
| 组织病理 | 振动切片机 | -- | -- |
| 扫描电子显微镜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者与对照样本来源、诊断标准、样本量（n=4） 阅读提示：Methods: Clinical samples |
| 细胞培养与处理 | PMCs分离方法、培养条件、处理物及浓度（BLM 0.2 μg/mL, TBPE 5%, 重组collagen VII 1 μg/mL） 阅读提示：Methods: Isolation and identification of primary human PMCs, Isolation of primary rat PMCs, Culture and treatment of cells |
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、诱导方法（BCG/TBPE/BLM+碳颗粒）、给药剂量、时间点（第21天） 阅读提示：Methods: Generation of Wt1-Cre+ Col7a1fl/fl mice and making of the mouse pleural fibrosis model |
| 力学检测 | 纳米压痕仪型号、探针参数、组织切片厚度、测量条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Methods: Detection of tissue stiffness and single-cell stiffness |
| 信号通路验证 | 抑制剂浓度（cilengitide 10 μg/mL）、siRNA序列、底物刚度（1, 10, 30, 50 kPa） 阅读提示：Methods: Culture and treatment of cells, Transfection of siRNA and plasmid, Preparation of polyacrylamide hydrogels and PDMS |