iPSC分化为肝细胞
建立来自T2D患者和对照的iHep模型，以研究肝细胞内在的胰岛素信号缺陷。
从8名T2D患者和8名对照的iPSC，使用4阶段生长因子方案分化为肝细胞（iHep），历时21天。
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2型糖尿病患者人iPS细胞来源肝细胞中细胞内在胰岛素信号缺陷
Cell-intrinsic insulin signaling defects in human iPS cell-derived hepatocytes in type 2 diabetes
实验完整度
高包含患者iPSC分化肝细胞模型、LC-MS/MS磷酸化蛋白质组学、激酶组预测和ROCK抑制剂功能验证，多个独立证据层级。
主要模型
人iPS细胞来源肝细胞（iHep） 来自8名T2D患者和8名对照的iPS细胞
重点核对
iHep分化方案（4阶段生长因子，21天） 胰岛素刺激条件：100 nM，10分钟 ROCK1/2抑制剂ripasudil处理：10 nM，3小时 磷酸化蛋白质组学分析方法：LC-MS/MS，DIA模式 样本量：8名对照和6名T2D（排除2个低质量样本）
摘要
肝脏胰岛素抵抗是2型糖尿病（T2D）和代谢综合征的核心，但由于组织获取受限，在人类中定义这一缺陷的分子基础具有挑战性。利用诱导多能干细胞分化为来自对照个体和T2D患者的肝细胞，并结合基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的磷酸化蛋白质组学分析，我们确定了T2D中信号传导的细胞内在改变的大型网络。超过300个磷酸化位点显示胰岛素信号受损或减弱，包括经典胰岛素刺激的PI3K/AKT级联及其下游靶标的缺失。此外，我们确定了超过500个新出现的（即新的或增强的）信号传导磷酸化位点。这些位点出现在参与Rho-GTPase通路、RNA代谢、囊泡运输和染色质修饰的蛋白质上。激酶组分析表明，受损的磷酸化位点代表AKT2/3、PKCθ、CHK2、PHKG2和/或STK32C激酶活性的降低。相比之下，新出现的磷酸化位点被预测由Rho相关激酶1和2（ROCK1/2）、哺乳动物STE20样蛋白激酶4（MST4）和/或支链α-酮酸脱氢酶激酶（BCKDK）活性增加介导。抑制T2D诱导多能干细胞来源肝细胞中的ROCK1/2活性可恢复胰岛素作用中的一些改变。因此，T2D肝脏中的胰岛素抵抗并非简单地涉及经典胰岛素信号的丧失，还涉及新磷酸化的出现，代表多种激酶平衡的改变。总之，这些导致肝脏胰岛素作用改变，并确定了肝胰岛素抵抗治疗的重要靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- T2D患者肝细胞中细胞内在的胰岛素信号缺陷的分子基础是什么？
- 核心机制
- T2D肝细胞中胰岛素信号缺陷包括经典信号（如AKT2）的受损和新信号（如ROCK1/2、MST4、BCKDK）的出现，导致磷酸化平衡改变。
- 主要证据
- 通过LC-MS/MS磷酸化蛋白质组学鉴定超过300个受损和超过500个新出现的磷酸化位点；激酶组分析预测相关激酶；ROCK1/2抑制剂ripasudil恢复部分胰岛素信号。
- 研究意义
- 确定T2D肝胰岛素抵抗中两种独立的磷酸化改变网络及涉及的潜在激酶，为治疗和预防T2D及胰岛素抵抗相关肝病提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证分化效率和肝细胞特征
确认iHep分化成功并具有成熟肝细胞特征。
通过qRT-PCR检测多能性标志物（OCT4、NANOG）和肝细胞标志物（ASGR1、ALB等）的表达；免疫印迹和流式细胞术检测白蛋白表达。
胰岛素刺激实验
检测对照和T2D iHep中胰岛素信号通路的变化。
将iHep用100 nM胰岛素刺激10分钟，检测胰岛素信号蛋白的磷酸化水平，如IR、AKT、GSK3、FOXO1。
磷酸化蛋白质组学分析
全面鉴定胰岛素刺激下对照和T2D iHep中的磷酸化位点变化，发现受损和新兴信号。
使用LC-MS/MS进行全局磷酸化蛋白质组学分析，包括样品制备、磷酸肽富集、质谱检测和数据分析。
激酶组分析
预测可能导致T2D中磷酸化变化的激酶。
使用303种丝氨酸/苏氨酸激酶的底物特异性数据库，分析磷酸化位点序列，预测激酶活性变化。
ROCK1/2抑制实验
验证ROCK1/2活性增加是否导致T2D iHep中胰岛素信号缺陷。
用ROCK1/2抑制剂ripasudil（10 nM）预处理iHep 3小时，然后胰岛素刺激，检测胰岛素信号蛋白的磷酸化变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTESR1培养基 | STEMCELL Technologies | -- |
| 细胞分化 | 激活素A | -- | -- |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子-2 | -- | -- | |
| 骨形态发生蛋白4 | -- | -- | |
| 肝细胞生长因子 | -- | -- | |
| 制瘤素 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 蛋白质组学样品制备 | 脱氧胆酸钠 | -- | -- |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| 2-氯乙酰胺 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 赖氨酰内肽酶 | -- | -- | |
| LC-MS/MS | Reprosil C18颗粒 | Dr. Maisch | -- |
| EASY-nLC 1000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | MilliporeSigma | -- | |
| 抗IRβ抗体（Tyr1150/1151） | Cell Signaling Technology | 3024 | |
| 抗IRβ抗体（4B8） | Cell Signaling Technology | 3025 | |
| 抗磷酸化AKT (Thr308)抗体 | Cell Signaling Technology | 13038 | |
| 抗磷酸化AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗总AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗磷酸化GSK-3α (Ser21)抗体 | Cell Signaling Technology | 9316 | |
| 抗GSK-3α抗体 | Cell Signaling Technology | 4818 | |
| 抗磷酸化FoxO1 (Thr24)/FoxO3a (Thr32)抗体 | Cell Signaling Technology | 9464 | |
| 抗FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | 2880 | |
| 抗磷酸化PRK1 (Thr774)/PRK2 (Thr816)抗体 | Cell Signaling Technology | 2611 | |
| 抗PKN1多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | 720396 | |
| 抗人血清白蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-29022 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | 高容量cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | iQSYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- |
| CFX384热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| 抑制剂处理 | 利帕舒地尔 | Cayman Chemical | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iPSC分化 | 细胞系来源、传代次数、各阶段生长因子浓度和处理时间 阅读提示：Methods：iPS cell culturing and differentiation into iHeps |
| 胰岛素刺激 | 胰岛素浓度（100 nM）、刺激时间（10分钟）、撤除地塞米松和胰岛素的时间 阅读提示：Methods：Insulin signaling and immunoblot analysis |
| 磷酸化蛋白质组学 | 样本制备方法（裂解、酶解、富集）、质谱方法（DIA模式）、数据处理流程 阅读提示：Methods：Cell lysate preparation, LC-MS/MS measurement, Phosphoproteomics analysis |
| ROCK1/2抑制实验 | ripasudil浓度（10 nM）、预处理时间（3小时）、胰岛素刺激条件 阅读提示：Methods：Insulin signaling and immunoblot analysis |