遗传学诊断
鉴定患者中RINT1致病性变异。
对患者进行全外显子组测序，并使用Sanger测序验证变异和分离分析。
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RINT1缺陷破坏脂质代谢并导致复杂性遗传性痉挛性截瘫
RINT1 deficiency disrupts lipid metabolism and underlies a complex hereditary spastic paraplegia
实验完整度
高包含患者临床表型与遗传分析、患者成纤维细胞功能实验（蛋白表达、自噬、脂滴、脂质组学、线粒体功能）及体内临床样本（血浆）多层级证据。
主要模型
患者皮肤成纤维细胞 患者血浆样本 患者外周血样本（用于WES）
重点核对
RINT1双等位基因变异类型及剪接异常导致的p.Phe558_Gln564del缺失 患者成纤维细胞中RINT1、ZW10、NBAS蛋白表达水平显著降低 成纤维细胞中脂滴数目增多而面积减小 成纤维细胞和血浆中甘油三酯、二甘油酯降低，磷脂（PC、PE、PS）升高 线粒体膜电位降低、ROS升高、ATP减少、DRP1磷酸化比例增加
摘要
Rad50相互作用蛋白1（Rint1）是内质网和高尔基体之间囊泡运输的关键参与者。RINT1的双等位基因变异导致婴儿期发作的偶发性急性肝功能衰竭（ALF）。在此，我们描述了来自2个无关家庭的3例携带新型RINT1功能缺失双等位基因变异的患者，他们表现为早发性痉挛性截瘫、共济失调、视神经发育不良和畸形特征，拓宽了先前描述的表型。我们的功能和脂质组学分析提供了证据，表明致病性RINT1变异诱导脂滴生物发生缺陷以及成纤维细胞和血浆中严重的脂质异常，影响中性脂质和磷脂代谢，包括甘油三酯和二甘油酯降低、磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸比值降低以及Lands循环抑制。此外，RINT1突变诱导细胞内活性氧产生并减少ATP合成，影响线粒体，导致膜去极化、嵴超微结构异常和分裂增加。总之，我们的结果强调了RINT1在脂质代谢和线粒体功能中的关键作用，对中枢神经系统发育有深远影响。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RINT1功能缺失变异是否与未报道的神经系统表型相关，并导致脂质代谢和线粒体功能异常。
- 核心机制
- RINT1功能缺失导致NRZ复合物不稳定，影响脂滴生物发生，引起脂质代谢紊乱（DGAT2下调、PCYT2上调、PLA2G6下调），进而导致线粒体分裂增加、功能障碍和氧化应激。
- 主要证据
- WES和Sanger测序鉴定RINT1致病变异；患者成纤维细胞和血浆脂质组学显示TG、DG降低，磷脂升高等；成纤维细胞中线粒体膜电位降低、ROS升高、ATP减少，DRP1磷酸化比例升高。
- 研究意义
- 本研究扩展了RINT1相关疾病的临床谱，并强调了RINT1在脂质代谢和线粒体功能中的关键作用，为神经发育和运动障碍中的脂质稳态异常提供了证据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
患者成纤维细胞分子表型分析
评估RINT1变异对NRZ复合物表达和定位的影响。
使用Western blot和免疫荧光检测RINT1、ZW10、NBAS蛋白表达和定位。
细胞生物学功能分析
检测RINT1变异对自噬、高尔基形态和脂滴的影响。
通过Bafilomycin A1处理检测LC3-II水平评估自噬流；共聚焦显微镜检测高尔基体积；Oil Red O染色检测脂滴数目和大小。
脂质组学分析
全面评估患者成纤维细胞和血浆中的脂质异常。
使用LC-HRMS对成纤维细胞和血浆样本进行脂质组学分析，检测中性脂质和磷脂。
基因表达分析
探究脂质代谢相关酶的表达变化。
通过RT-qPCR检测DGAT1、DGAT2、PCYT2、PLA2G6、SREBP-1c、FASN的表达。
线粒体功能与形态分析
评估RINT1变异对线粒体形态、功能和生物能量学的影响。
使用MitoTracker Orange和TOMM20染色观察线粒体形态；TEM分析线粒体超微结构；检测ATP、膜电位、ROS；Western blot检测DRP1磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 无葡萄糖DMEM | Biological Industries | -- | |
| 自噬检测 | 巴佛洛霉素A1 | Merck | 88899-55-2 |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript IV试剂盒 | Life Technologies | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- | |
| iBlot 2凝胶转印仪 | Invitrogen | -- | |
| 增强化学发光系统 | GE Healthcare | -- | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| ImageLab软件 | Bio-Rad | -- | |
| 抗RINT1抗体 | Merck | HPA019875 | |
| 抗ZW10抗体 | Proteintech | 24561-AP | |
| 抗NBAS抗体 | Abcam | ab122370 | |
| 抗RAB18抗体 | Proteintech | 11304-1-AP | |
| 抗p62抗体 | Abcam | ab56416 | |
| 抗LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 2775 | |
| 抗VDAC1抗体 | Abcam | ab15895 | |
| 抗线粒体复合体III抗体 | Molecular Probes | A21362 | |
| 抗线粒体复合体IV抗体 | Invitrogen | A21348 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab80779 | |
| 抗DRP1抗体 | Cell Signaling Technology | 14647 | |
| 抗磷酸化DRP1 (Ser616)抗体 | Cell Signaling Technology | 3455 | |
| 抗磷酸化DRP1 (Ser637)抗体 | Cell Signaling Technology | 6319 | |
| 抗MFN1抗体 | Proteintech | 13798-1-AP | |
| 抗MFN2抗体 | Sigma-Aldrich | M6444 | |
| 抗OPA1抗体 | BD Transduction Laboratories | 612607 | |
| HRP标记的抗小鼠抗体 | Dako | P0447 | |
| HRP标记的抗兔抗体 | Dako | P0448 | |
| 免疫荧光 | 抗Calnexin抗体 | Novus Biologicals | NB300-518 |
| 抗TOMM20抗体 | Abcam | Ab56783 | |
| Alexa 647标记的抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | A21236 | |
| Alexa 488标记的抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | |
| 线粒体染色 | MitoTracker Orange探针 | Thermo Fisher Scientific | M7510 |
| 脂滴染色 | 油红O | Merck | 1320-06-5 |
| 显微镜 | Leica TCS SL激光扫描共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | NIH | -- |
| 3D重建 | Imaris 9.7.2软件 | Bitplane | -- |
| 电镜 | 环氧树脂 | Ted Pella | -- |
| Leica EM UC6超薄切片机 | Leica | -- | |
| 醋酸铀 | -- | 541-09-3 | |
| 柠檬酸铅 | EMS | 512-26-5 | |
| Jeol JEM-1010透射电子显微镜 | Jeol | -- | |
| CCD Orius相机 | GATAN | -- | |
| 脂质组学 | Histopaque分离液 | Merck | -- |
| 内标 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| Acquity UHPLC系统 | Waters | -- | |
| LCT Premier XE飞行时间检测器 | Waters | -- | |
| Acquity UHPLC BEH C8色谱柱 | Waters | -- | |
| RNA表达 | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| LightCycler 480 RT-PCR系统 | Roche Diagnostics | -- | |
| TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | -- | |
| ATP测量 | ATPlite 1step系统 | PerkinElmer | -- |
| 线粒体膜电位 | TMRE探针 | Molecular Probes | -- |
| 流式细胞术 | Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| ROS测量 | H2-DCFDA探针 | Thermo Fisher Scientific | 4091-99-0 |
| 统计 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者成纤维细胞培养 | DMEM培养基（Gibco）、10% FBS、100 μg/mL青霉素-链霉素，37°C、5% CO2。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| 葡萄糖剥夺实验 | 无葡萄糖DMEM（Biological Industries）补充L-谷氨酰胺、10% FBS、100 μg/mL青霉素-链霉素，处理16小时。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| 自噬流检测 | 无血清培养基，400 nM Bafilomycin A1处理4小时。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment; Figure 3 legend |
| 免疫印迹 | 使用RIPA缓冲液裂解，并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂；抗体稀释比例：anti-RINT1 1:1000, anti-ZW10 1:1000等。 阅读提示：Methods: Western blotting |
| 脂滴染色 | Oil Red O工作液配方：100 mg Oil Red O溶于20 mL 60%三乙基磷酸，用15 mL工作液加8 mL ddH2O，过滤两次；固定使用10%甲醛。 阅读提示：Methods: Microscopy analysis |
| 脂质组学 | 血浆和成纤维细胞样本准备；使用甲醇-氯仿(1:2)提取，添加内标；LC-HRMS分析，使用Acquity UPLC BEH C8柱。 阅读提示：Methods: Lipidomics profiling |
| 线粒体形态分析 | MitoTracker Orange染色（15分钟，37°C）和TOMM20抗体染色；使用ImageJ分析线粒体大小和数目。 阅读提示：Methods: Microscopy analysis; Figure 7 legend |
| 线粒体膜电位检测 | 50 nM TMRE孵育30分钟，流式细胞仪分析。 阅读提示：Methods: Inner mitochondrial membrane potential quantification |
| ROS检测 | 10 μM H2-DCFDA孵育30分钟，荧光分光光度计测量（激发493 nm，发射527 nm）。 阅读提示：Methods: Intracellular ROS measurement |