细胞转导与培养
制备带有gRNA库和UMI条形码的CD8+ T细胞，用于体内筛选。
从OT-1 Cas9小鼠脾脏分离初始CD8+ T细胞，用携带gRNA和Thy1.1报告基因的慢病毒转导，在含IL-7的完全RPMI中培养7天以维持初始状态并表达Thy1.1。
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体内T细胞筛选的框架
Framework for in vivo T cell screens
实验完整度
高包含体外细胞培养与转导、体内B16-OVA肿瘤模型、多个体内筛选实验（100-gRNA筛选、多LN筛选）、计算建模（恢复率计算、UMI降采样分析）及功能验证（KO基因对T细胞丰度的影响），并进行了统计验证。
主要模型
OT-1 TCR转基因小鼠来源的CD8+ T细胞 B16-OVA黑色素瘤小鼠模型 Cas9表达小鼠（C57BL/6背景）作为过继转移受体 体外培养的CD8+ T细胞（经慢病毒转导）
重点核对
OT-1 CD8+ T细胞过继转移剂量为300,000个细胞/只小鼠（图1b，材料与方法） B16-OVA肿瘤细胞注射剂量为5×10^6个细胞/只小鼠（材料与方法） gRNA文库大小和UMI数量（如100-gRNA文库含96 UMIs，导致9,600 gRNA-UMI组合）（图2c，材料与方法） 小鼠池的组成（例如，每组8或10只小鼠，以及池数）（图2c，图5a） FAUST参数：使用Mann-Whitney U检验，默认双尾，目标gRNA与对照gRNA比较（材料与方法）
摘要
体内T细胞筛选是阐明复杂免疫机制的有力工具，然而对于稳健的体内筛选所需的筛选设计参数（基因文库大小、细胞转移数量和小鼠数量）缺乏共识。在此，我们描述了体内T细胞筛选框架（FITS），以提供实验和分析指南，用于确定不同体内环境下的最佳参数。作为概念验证，我们使用FITS优化了B16-OVA肿瘤模型中CD8+ T细胞筛选的参数。我们还在筛选中加入了独特的分子标识符（UMI），以（1）提高统计功效和（2）追踪不同基因敲除（KO）在多个组织中的T细胞克隆动态。这些发现为在免疫细胞中进行体内筛选提供了实验和分析框架，并展示了带UMI的体内T细胞筛选的案例研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计优化参数（细胞转移数量、基因数量、小鼠数量）以进行稳健的体内T细胞筛选，并利用UMI提高统计功效和追踪克隆动态？
- 核心机制
- FITS框架通过优化过继转移T细胞剂量、计算植入率、建模最佳基因和小鼠数量，并使用UMI作为细胞克隆的分子条形码，追踪不同基因敲除的T细胞克隆在不同组织中的扩增和迁移。
- 主要证据
- 在B16-OVA模型中，对CD8+ T细胞进行慢病毒转导、过继转移和gRNA-UMI测序，发现约2%的植入率，鉴定出tdLN和肿瘤中调节T细胞增殖的基因（如Zc3h12a、Ptpn2、Pdcd1等），并通过FAUST分析UMI级别数据，揭示了基因KO的克隆扩增模式（如Zc3h12a全局扩增、Ptpn2肿瘤内扩增）。
- 研究意义
- FITS为在不同免疫学背景下设计和分析稳健的体内T细胞筛选提供了模板，并展示了UMI在提高统计功效和追踪克隆反应中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
过继转移与肿瘤接种
将转导的T细胞转移到受体小鼠，并建立B16-OVA肿瘤模型以评估T细胞反应。
将分选的Thy1.1+ CD8+ T细胞经静脉注射到Cas9表达受体小鼠，次日皮下接种B16-OVA肿瘤细胞。
组织分离与T细胞富集
从肿瘤和相关淋巴结中分离过继转移的T细胞，用于分析。
肿瘤和淋巴结分别收获，肿瘤用胶原酶消化，两者通过机械分离获得单细胞悬液，用CD8α磁珠富集CD8+ T细胞。
流式分选与测序
获得纯化的转移T细胞用于基因分型和文库分析。
细胞染色后，通过流式分选获得活CD8β+ Thy1.1+ CD44+ T细胞，提取基因组DNA，PCR扩增gRNA-UMI区域，进行高通量测序。
生物信息学分析
从测序数据中提取gRNA-UMI计数，评估文库恢复、基因效应和克隆动态。
使用PoolQ软件对测序数据进行解复用和计数，然后进行log2归一化、计算fold change、统计检验（FAUST等）、UMI降采样分析、MOI计算等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和转导 | DMEM培养基 | Gibco | 11995073 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| 青霉素/链霉素 | VWR | 97063-708 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES缓冲液 | VWR | 97064-360 | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific | 11-140-050 | |
| 重组小鼠IL-7 | VWR | 10780-184 | |
| LentiBOOST转导增强剂 | Sirion Biotech | -- | |
| RetroNectin逆转录病毒转导增强剂 | Takara Bio | T100B | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| 无钙镁磷酸盐缓冲液 | VWR | 82020-066 | |
| Naive CD8a+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-096-543 | |
| pRDA_526质粒 | Addgene | ID: | |
| pXPR_071质粒 | Addgene | ID: | |
| pLX_305质粒 | Broad Institute Genetic Perturbation Platform | -- | |
| pCag-Eco包装质粒 | Addgene | ID: | |
| pMD2.G包装质粒 | Addgene | ID: | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | ID: | |
| LT-1转染试剂 | Mirus Bio | MIR2305 | |
| 嘌呤霉素 | VWR | 10766-886 | |
| 肿瘤模型建立 | B16-OVA细胞 | Glenn Dranoff实验室 | -- |
| 293x细胞 | Cigall Kadoch实验室 | -- | |
| 肿瘤处理 | I型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004194 |
| Optiprep密度梯度介质 | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| CD8α磁珠 | Miltenyi | 130-117-044 | |
| 淋巴结处理 | CD8α磁珠 | Miltenyi | 130-117-044 |
| 流式细胞术 | FACSDIVA软件 | BD Biosciences | Version |
| Flowjo软件 | BD Biosciences | Version | |
| 7-AAD染色液 | Biolegend | 420404 | |
| Near-IR可固定活/死染料 | Thermo Fisher Scientific | L34976 | |
| B220抗体（克隆RA3-6B2） | Biolegend | 103208 | |
| CD25抗体（克隆PC61） | Biolegend | 102012 | |
| CD44抗体（克隆IM7） | Biolegend | 103006, | |
| CD45.1抗体（克隆A20） | Biolegend | 110708 | |
| CD45.2抗体（克隆104） | Biolegend | 109824 | |
| CD62L抗体（克隆MEL-14） | Biolegend | 104417 | |
| CD8β抗体（克隆YTS156.7.7） | Biolegend | 126610, | |
| Gr-1抗体（克隆RB6-8C5） | Biolegend | 108408 | |
| PD-1抗体（克隆29F.1A12） | Biolegend | 135214 | |
| Ter-119抗体（克隆TER-119） | Biolegend | 116208 | |
| Thy1.1抗体（克隆OX-7） | Biolegend | 202529 | |
| TruStain FcX抗体（克隆93） | Biolegend | 101320 | |
| TCR Vα2抗体（克隆B20.1） | Biolegend | 127822 | |
| 分子生物学 | BsmBI限制酶 | NEB | R0580L |
| Stbl4感受态细菌 | Thermo Fisher Scientific | 11635-018 | |
| HiSpeed质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12662 | |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| DNA定量和质量检查 | Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 |
| Titanium Taq DNA聚合酶 | Takara | 638517 | |
| 测序 | HiSeq2000测序仪 | Illumina | -- |
| 磁珠富集 | LS柱子 | Miltenyi | 130-042-401 |
| 超纯抗PE微珠 | Miltenyi | 130-105-639 | |
| 细胞培养和转导 | 2,2,2-三溴乙醇 | VWR | AAA18706-22 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和转导 | 细胞来源：OT-1 Cas9小鼠脾脏；转导：慢病毒，含gRNA-UMI库和Thy1.1报告；培养：完全RPMI，1 ng/ml IL-7，7天；分选：活Thy1.1+ CD8+ T细胞。 阅读提示：Materials and methods: Mouse strains, Lentiviral transduction, Flow cytometry and cell sorting |
| 过继转移和肿瘤模型 | 受体小鼠：Cas9表达小鼠（Thy1.2+），7-16周龄；细胞转移剂量：300,000细胞/只；肿瘤细胞：B16-OVA，5×10^6细胞/只，皮下注射。 阅读提示：Materials and methods: Mouse strains, Tumor injection |
| 组织处理和细胞分离 | 肿瘤：机械切碎，胶原酶I型处理20分钟，Optiprep梯度，CD8α磁珠富集；淋巴结：机械分离，CD8α磁珠富集。 阅读提示：Materials and methods: Tumor-infiltrating lymphocyte isolation and CD8+ T cell enrichment, LN isolation and CD8+ T cell enrichment |
| 流式分选和测序 | 分选标志物：活细胞CD8β+ Thy1.1+ CD44+ TCR Vα2+（肿瘤）、CD8β+ Thy1.1+ CD44+（LN）；测序：HiSeq2000，50-bp读长，8-bp索引。 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry and cell sorting, Sequencing, Sequencing deconvolution |
| 生物信息学分析 | 归一化：log2，每百万计数；fold change计算；统计检验：FAUST（Mann-Whitney U，保守/自由模式），q<0.05；ICC2计算。 阅读提示：Materials and methods: FAUST algorithm, UMI downsampling, Fold change plots |