EC-周细胞串扰图谱构建
系统鉴定健康和LPS诱导ALI肺中EC-周细胞间的分子通讯
从Pdgfrb-EGFP小鼠肺中分离EC和周细胞，进行RNA-seq，并利用扩展的细胞-细胞相互作用数据库进行串扰分析
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
激活小鼠血管微环境中的NO-sGC串扰促进血管完整性并减轻急性肺损伤
Activating NO-sGC crosstalk in the mouse vascular niche promotes vascular integrity and mitigates acute lung injury
实验完整度
高包含体内小鼠模型（LPS诱导ALI）、细胞特异性基因敲除、体外微流体芯片、转录组分析及电镜形态学等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Pdgfrb-EGFP小鼠（肺内皮细胞和周细胞） LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型 Gucy1a1-EGFP报告小鼠 HUVEC和HBVP共培养的微流体芯片血管网络
重点核对
LPS诱导ALI小鼠模型（气管内滴注2 mg/kg LPS） Riociguat给药方案（20 mg/kg，每9小时口服，伤后3小时开始） 周细胞特异性sGC敲除小鼠（Cspg4-CreERT2::Gucy1b1flox/flox） 体外微流体芯片实验（HUVEC和HBVP共培养，TNFα刺激） 血管通透性检测（Evans blue渗漏实验）
摘要
内皮细胞（EC）与周细胞相互作用的破坏会导致急性肺损伤（ALI）中的血管渗漏。然而，介导EC-周细胞串扰的分子信号尚未被系统研究，且靶向这种串扰是否可用于对抗ALI仍不清楚。通过对健康和脂多糖（LPS）攻击肺的比较全基因组EC-周细胞串扰分析，我们发现内皮型一氧化氮与周细胞可溶性鸟苷酸环化酶（NO-sGC）之间的串扰在ALI中受损。确实，刺激NO-sGC通路可促进血管完整性并减少肺水肿和炎症诱导的肺损伤，而周细胞特异性sGC敲除则消除了这种保护作用。机制上，sGC激活通过抑制VASP依赖的F-actin形成和MRTFA/SRF依赖的与细胞骨架重排相关基因的从头合成，抑制周细胞中的细胞骨架重排，从而稳定EC-周细胞相互作用。总之，我们的数据表明，血管微环境中受损的NO-sGC串扰导致血管通透性升高，而药理学激活该串扰代表了一种有前景的ALI转化疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些分子信号介导EC-周细胞串扰并在急性肺损伤中调控血管完整性，以及靶向该串扰是否可作为治疗策略？
- 核心机制
- 内皮细胞来源的NO激活周细胞中的sGC，进而通过cGMP-PKG1-VASP通路抑制F-actin形成，并阻止MRTFA核转位，从而抑制SRF依赖的细胞骨架基因从头合成，稳定周细胞形态和EC-周细胞相互作用，维持血管完整性。
- 主要证据
- 全基因组EC-周细胞串扰分析发现NO-sGC是LPS处理后下调最显著的EC→周细胞相互作用；Riociguat激活sGC可减少血管渗漏和肺损伤；周细胞特异性sGC敲除消除保护效应；体外实验证实8-Br-cGMP抑制TNFα诱导的周细胞F-actin形成和MRTFA核转位。
- 研究意义
- 本研究首次描绘了EC-周细胞串扰图谱，并证明药理学激活NO-sGC信号可促进血管完整性、减轻急性肺损伤，为ALI及其他血管渗漏综合征提供了潜在的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NO-sGC串扰受损鉴定
验证LPS处理后EC-周细胞间NO-sGC信号受损
检测肺中eNOS和sGC的表达，并用免疫染色验证sGC在周细胞中的表达
Riociguat治疗效果评估
验证药理学激活sGC是否能减轻LPS诱导的肺损伤
在LPS损伤后给予Riociguat治疗，评估血管渗漏、肺水肿、炎症细胞浸润和肺组织学变化
周细胞sGC必要性验证
确定Riociguat的保护作用是否依赖于周细胞sGC
利用周细胞、平滑肌细胞或血小板特异性sGC敲除小鼠，评估Riociguat对LPS诱导肺损伤的影响
体外微流体芯片验证
在仅含EC和周细胞的微流体血管网络中验证NO-sGC激活对血管完整性的直接作用
将HUVEC和HBVP共培养于微流体芯片形成血管网络，用TNFα诱导炎症，并用8-Br-cGMP激活sGC下游，评估血管渗漏和周细胞形态变化
机制解析
阐明sGC激活稳定周细胞形态的分子机制
进行转录组学和转录因子富集分析，验证VASP磷酸化和MRTFA核转位是否受sGC信号调控
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 利奥西呱 | Selleck | S8135 |
| 细胞培养 | 人脐静脉内皮细胞 | PromoCell | C-12208 |
| 内皮细胞生长培养基2 | PromoCell | C-22011 | |
| 人脑血管周细胞 | ScienceCell | 1200 | |
| 周细胞培养基 | ScienceCell | 1201 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070063 | |
| I型胶原蛋白 | Corning | 354249m | |
| 8-溴环磷酸鸟苷 | Sigma-Aldrich | B1381 | |
| 肿瘤坏死因子α | R&D | 210-TA-100 | |
| 动物实验 | 脂多糖 | -- | -- |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| 血管通透性检测 | 伊文思蓝 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | 217004 | |
| cDNA合成 | ReverTra Ace qPCR RT预混液 | Toyobo | FSQ-301 |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Invitrogen | A25778 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Yeason | 20201ES76 |
| 蛋白检测 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sangon | B14001 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sangon | B15001 | |
| ELISA | 小鼠CCL2酶联免疫吸附试剂盒 | Beyotime | PC125 |
| 免疫荧光 | 兔抗GUCY1A1抗体 | Proteintech | 12605-1-AP |
| 兔抗PDGFRβ抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-15143 | |
| 兔抗NG2抗体 | Abcam | ab129051 | |
| 兔抗Desmin抗体 | Abcam | Ab15200-1 | |
| 大鼠抗TER119抗体 | BD | 557915 | |
| 大鼠抗GR1抗体 | Biolegend | 108419 | |
| 仓鼠抗CD31抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | |
| 小鼠抗eNOS抗体 | Abcam | ab76198 | |
| Western blot | 兔抗GUCY1B1抗体 | Abcam | ab154841 |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | TransGen | HC301-02 | |
| 小鼠抗Tubulin抗体 | Transgenbiotech | HC-101-01 | |
| 兔抗p-eNOS(Ser1177)抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-97371 | |
| 兔抗VASP抗体 | Cell Signaling Technology | 3132S | |
| 兔抗p-VASP(Ser239)抗体 | Cell Signaling Technology | 3114S | |
| HRP偶联驴抗兔IgG | Jackson | 711-036-152 | |
| HRP偶联驴抗小鼠IgG | Jackson | 715-036-151 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系（Pdgfrb-EGFP、Gucy1a1-EGFP等）、性别（雄性）、周龄（8周）、LPS剂量（2 mg/kg气管内滴注或6 mg/kg腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods - Mouse experiments 和 Intratracheal LPS instillation-induced lung injury model |
| 药物处理 | Riociguat剂量（20 mg/kg）、给药途径（口服灌胃）、给药间隔（每9小时）、首次给药时间（LPS后3小时） 阅读提示：Materials and methods - Riociguat treatment regimen |
| 血管通透性检测 | Evans blue剂量（30 mg/kg）、尾静脉注射时间（处死前2小时）、灌注条件（EDTA缓冲液，8 ml/min，5分钟） 阅读提示：Materials and methods - Evans blue permeability assay |
| 细胞培养与体外实验 | HUVEC和HBVP的来源与代数（不超过第6代）、培养条件（37°C、5% CO2）、TNFα浓度（100 ng/ml）、8-Br-cGMP浓度（50 µM） 阅读提示：Materials and methods - Cell culture 和 Microfluidic chip assay |
| 基因敲除 | 他莫昔芬剂量（100 μl，20 mg/ml）、注射天数（连续5天）、诱导周龄（4周）、敲除效率验证（qPCR和Western blot） 阅读提示：Materials and methods - Pericyte-, vSMC-, or platelet-specific Gucy1b1 deletion |