检测系统性感染后肾脏免疫细胞IRE1α激活
评估白色念珠菌感染是否在体内诱导肾脏浸润免疫细胞中IRE1α的激活。
使用ERAI报告小鼠，流式细胞术检测肾脏浸润中性粒细胞、单核细胞等免疫细胞中Venus报告基因表达，并通过RT-qPCR检测分离的肾脏中性粒细胞中UPR标记基因表达。
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炎症性内质网应激反应决定系统性念珠菌病的免疫病理进展
Inflammatory ER stress responses dictate the immunopathogenic progression of systemic candidiasis
实验完整度
高包含体外细胞实验、条件性基因敲除小鼠、转录组学和体内药理学干预等多层次验证，明确功能与机制。
主要模型
小鼠系统性白色念珠菌感染模型 骨髓来源中性粒细胞 骨髓来源单核细胞 ERAI报告小鼠
重点核对
C. albicans SC5314菌株，静脉注射剂量1×10^5细胞 Ern1fl/flVav1Cre小鼠条件性敲除IRE1α MKC8866（300 mg/kg）口服灌胃治疗时间窗口 肾脏组织细胞因子和前列腺素E2水平检测 肾组织病理学评分标准
摘要
识别病原体相关分子模式可触发先天免疫细胞中内质网应激反应的肌醇需求酶1α（IRE1α）分支。这一过程维持内质网稳态，并在细菌和病毒感染期间协调多种免疫调节程序。然而，先天IRE1α信号在应对真菌病原体中的作用仍不明确。在此，我们报道，人类机会性真菌病原体白色念珠菌的系统性感染会诱导髓系细胞中促炎性IRE1α过度激活，从而导致致命的肾脏免疫病理。机制上，白色念珠菌同时激活TLR/IL-1R适配蛋白MyD88和C型凝集素受体dectin-1，诱导NADPH氧化酶驱动的活性氧产生，进而引起内质网应激和IRE1α依赖性的关键炎症介质（如IL-1β、IL-6、趋化因子（C-C基序）配体5（CCL5）、前列腺素E2（PGE2）和TNF-α）的过度表达。在白细胞中选择性敲除IRE1α，或使用IRE1α药理学抑制剂治疗，可减轻肾脏炎症并延长系统性白色念珠菌感染小鼠的生存期。因此，控制IRE1α过度激活可能有助于阻止播散性念珠菌病的免疫病理进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 免疫细胞内质网应激传感器IRE1α在系统性白色念珠菌感染中是否以及如何影响疾病进展？
- 核心机制
- 白色念珠菌通过dectin-1和MyD88信号激活Src-Syk-NOX通路，产生ROS和脂质过氧化产物，导致髓系细胞IRE1α过度激活，进而驱动多种炎症介质（如IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL5、PGE2）过表达，促进肾脏免疫病理和致死性进展。
- 主要证据
- ERAI报告小鼠和免疫细胞分析显示肾脏浸润的中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞IRE1α激活；条件性敲除或药理学抑制IRE1α减少肾脏炎症和损伤并延长生存期，而不影响真菌负荷。
- 研究意义
- 靶向IRE1α可能作为控制播散性念珠菌病过度炎症和肾脏损伤的治疗策略，并提示类似抑制剂如ORIN1001在临床中的潜在应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证β-葡聚糖和白色念珠菌诱导的IRE1α激活机制
确定髓系细胞感应白色念珠菌后IRE1α激活所需的信号通路。
分离骨髓中性粒细胞和单核细胞，用zymosan或HKCA刺激，检测IRE1α激活（Xbp1剪接）及信号通路抑制剂的影响。
评估IRE1α敲除对生存和真菌负荷的影响
研究造血细胞或中性粒细胞中IRE1α缺失对系统性念珠菌病小鼠生存和肾脏真菌负担的效应。
使用Ern1fl/flVav1Cre和Ern1fl/flMrp8Cre小鼠及其对照，静脉感染后监测生存曲线和肾脏真菌载量。
评估IRE1α敲除对肾脏病理和炎症的影响
确定IRE1α缺失是否减少肾脏免疫病理和炎症介质的产生。
感染后第1、3、5、7天取肾，进行免疫细胞计数、H&E染色和组织病理学评分，并分析肾脏匀浆上清中的细胞因子和PGE2水平。
转录组学分析
揭示IRE1α控制的转录程序，解释其促进炎症的作用。
感染后36小时分选肾脏浸润的中性粒细胞和单核细胞，进行RNA-Seq，分析差异表达基因和通路富集。
药理抑制IRE1α的治疗效果评估
评估小分子抑制剂MKC8866对系统性念珠菌病小鼠肾脏炎症和生存的影响。
感染后24小时开始，通过口服灌胃给予MKC8866（300 mg/kg），持续5-10天，检测肾脏Xbp1s、细胞因子水平并监测生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与刺激 | 中性粒细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-097-658 |
| 单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-100-629 | |
| RNA分离与qPCR | RNeasy微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| QIAzol裂解试剂 | QIAGEN | -- | |
| qScript cDNA合成试剂盒 | Quantabio | -- | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | -- | |
| QuantStudio 6 Flex实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞刺激 | 酵母聚糖 | MilliporeSigma | Z4250-1G |
| 热碱处理的酵母聚糖 | Invivogen | tlrl-zyd | |
| 凝胶多糖 | Invivogen | tlrl-curd | |
| ROS检测 | DCFDA | Thermo Fisher Scientific | C6827 |
| ROS抑制 | VAS-2870 | Enzo Biosciences | BML-E1395-001 |
| DPI | MilliporeSigma | D2926-10MG | |
| Mito-TEMPO | MilliporeSigma | SML0737-5MG | |
| MitoQ | Cayman Chemicals | 89950-1MG | |
| 脂质过氧化抑制 | 肼苯哒嗪 | MilliporeSigma | H1753-5G |
| ThT染色 | 硫黄素T | Abcam | ab120751 |
| 流式抗体 | 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 562420 |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 101228 | |
| 抗Ly6G抗体 | BD Biosciences | 741813 | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | L34975 |
| Fortessa-X20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 吞噬实验 | FITC标记的酵母聚糖 | Thermo Fisher Scientific | Z2841 |
| LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| MPO检测 | MPO小鼠ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EMMPO |
| NETs检测 | Sytox Green核酸染料 | Thermo Fisher Scientific | S7020 |
| 细胞因子检测 | 小鼠细胞因子/趋化因子阵列44-Plex | EVE Technologies | -- |
| PGE2检测 | PGE2 ELISA试剂盒 | Enzo Lifesciences | ADI-900-001 |
| 药物处理 | MKC8866 | MedChemExpress | HY-104040 |
| 流式抗体 | 抗CD3抗体 | BioLegend | 100216 |
| 抗CD19抗体 | BD Biosciences | 612781 | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123110 | |
| 抗CD11c抗体 | BD Biosciences | 744180 | |
| 抗I-A/I-E抗体 | BioLegend | 107620 | |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | 128041 | |
| 抗Ly6G抗体 | Tonbo Biosciences | 20-1276-U100 | |
| 抗NK1.1抗体 | BioLegend | 108748 | |
| 组织学 | 抗MPO抗体 | Dako | A0398 |
| 抗CD45抗体 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Leica Bond RX自动染色仪 | Leica Biosystems | -- | |
| Bond Polymer Refine检测系统 | Leica Biosystems | DS9800 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 感染模型 | C. albicans SC5314菌株，培养条件（YPD，30°C，16小时），静脉注射剂量1×10^5细胞/小鼠 阅读提示：Methods: In vivo C. albicans infection |
| IRE1α检测 | ERAI小鼠或Ern1fl/flVav1Cre小鼠的使用，流式抗体克隆和浓度，RT-qPCR引物序列 阅读提示：Methods: Transgenic mice, RNA isolation, RT-qPCR, and Xbp1 splicing assays; Figure 1 |
| 体外刺激 | 骨髓中性粒细胞或单核细胞的分离纯度，刺激物及浓度（zymosan 25 μg/mL, HKCA MOI=1或10），刺激时间6小时 阅读提示：Methods: Isolation of neutrophils and monocytes, C. albicans and β-glucans |
| 信号通路抑制 | 抑制剂浓度和处理时间：PP2 (10 μM), R406 (2.5 μM), DPI (10 μM), VAS-2870 (10 μM), Mito-TEMPO (10 μM), MitoQ (2 μM), hydralazine (100 μg/mL) 阅读提示：Methods: ROS analysis and targeting |
| 药物处理 | MKC8866剂量（300 mg/kg）、给药途径（口服灌胃）、给药时间（感染后24小时开始，每日一次，持续5-10天）、溶剂配制（1%微晶纤维素+50%蔗糖） 阅读提示：Methods: In vivo treatment with MKC8866 |