尽管进行了数十年的抗逆转录病毒治疗,可诱导的、具有感染性的HIV-1潜伏储存库并未减少

The latent reservoir of inducible, infectious HIV-1 does not decrease despite decades of antiretroviral therapy

作者信息Natalie F McMyn, Joseph Varriale, Emily J Fray, Carolin Zitzmann, Hannah MacLeod, Jun Lai, Anushka Singhal, Milica Moskovljevic, Mauro A Garcia, Brianna M Lopez, Vivek Hariharan, Kyle Rhodehouse, Kenneth Lynn, Pablo Tebas, Karam Mounzer, Luis J Montaner, Erika Benko, Colin Kovacs, Rebecca Hoh, Francesco R Simonetti, Gregory M Laird, Steven G Deeks, Ruy M Ribeiro, Alan S Perelson, Robert F Siliciano, Janet M Siliciano
PMID37463049
发布时间2023-09-01
DOI10.1172/JCI171554

实验完整度

研究包含体外实验(QVOA、IPDA)、患者样本(42例长期ART感染者)及纵向分析,并进行了功能验证(病毒诱导)和机制验证(克隆增殖,高clonality)。

主要模型

42例长期ART的HIV-1感染者 静息CD4+ T细胞 MOLT-4/CCR5细胞系

重点核对

供体的ART持续时间(平均22年)及血浆病毒载量抑制情况 QVOA中使用的PHA浓度(0.5 μg/mL)和IL-2浓度(100 U/mL) IPDA检测的完整原病毒频率

摘要

尽管进行了抗逆转录病毒治疗(ART),HIV-1仍以潜伏形式存在于静息CD4+ T细胞中。在ART的前7年,该储存库缓慢衰减(半衰期t1/2 = 44个月)。然而,长期ART后衰减是否持续尚不清楚。最近的整合位点研究表明,可诱导的、完整的原病毒逐渐被选择性地清除,这引发了人们的猜测,即数十年的ART或许可使治疗中断而不会出现病毒反弹。因此,我们使用定量病毒生长试验(QVOA)对42名接受长期ART(平均22年)的感染者进行了储存库测量。在ART 7年后,可诱导的、具有复制能力的原病毒频率并未出现长期下降,反而有所增加,估计倍增时间为23年。另一种储存库检测方法,即完整原病毒DNA试验(IPDA),证实了在长期ART下,以44个月半衰期衰减的现象并未持续。缺乏衰减反映了感染细胞的增殖。绝大多数(79.8%)可诱导的、具有复制能力的病毒具有与其他分离株相同的env序列。因此,尽管整合位点分析表明储存库组成发生变化,但CD4+ T细胞的增殖抵消了衰减,使可诱导的、具有复制能力的原病毒频率在长期内大致保持恒定。这些结果强调了终身ART的必要性。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
在非常长期的抗逆转录病毒治疗下,可诱导的、具有复制能力的HIV-1潜伏储存库是否继续衰减?
核心机制
CD4+ T细胞的克隆增殖抵消了潜伏储存库的衰减,导致可诱导的、具有复制能力的原病毒频率长期保持稳定甚至缓慢增加。
主要证据
QVOA和IPDA检测显示,长期ART后储存库未按预期的44个月半衰期衰减;env序列分析显示79.8%的复制能力病毒具有相同的env序列,表明克隆扩增。
研究意义
该研究强调,无论治疗时间多长,持续ART对于维持病毒抑制和防止反弹仍是必要的。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

研究参与者队列建立

纳入长期ART且病毒抑制良好的HIV-1感染者。

从多个诊所招募42名长期ART(平均22年)的感染者,通过临床记录确认病毒抑制。

2

静息CD4+ T细胞分离

获取用于储存库检测的静息CD4+ T细胞。

通过ficoll梯度离心和阴性选择分离静息CD4+ T细胞。

3

定量病毒生长试验(QVOA)

定量检测可诱导的、具有复制能力的病毒频率。

使用极限稀释培养法,通过PHA和IL-2激活静息CD4+ T细胞,与MOLT-4/CCR5细胞共培养,检测p24抗原。

4

完整原病毒DNA试验(IPDA)

定量检测遗传完整的原病毒频率并与QVOA结果比较。

提取静息CD4+ T细胞基因组DNA,使用IPDA试剂盒检测原病毒的完整性和缺失类型。

5

病毒序列和克隆性分析

评估病毒克隆性,判断是否由细胞增殖维持。

对QVOA阳性孔的上清液病毒RNA和静息CD4+ T细胞的原病毒DNA进行env单基因组测序,构建系统发育树。

6

衰减模型拟合

分析储存库随时间的变化模式。

使用混合效应模型拟合QVOA和IPDA数据,评估指数衰减、分段指数衰减或双指数模型。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
EasySep人CD4+ T细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies--
CD25微珠IIMiltenyi Biotec130-092-983
CD69微珠试剂盒IIMiltenyi Biotec130-092-355
抗HLA-DR微珠Miltenyi Biotec130-046-101
植物血凝素----
MOLT-4/CCR5细胞系American Type Culture Collection--
白细胞介素-2----
p24抗原ELISAPerkinElmerNEK050B001KT
QIAamp DNA迷你试剂盒Qiagen51306
96孔离心板Zymo ResearchR1041
RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂Invitrogen10777019
SuperScript III逆转录酶Invitrogen18080044
Gentra Puregene试剂盒Qiagen158043
plexWell 384seqWellPW384
MiSeq试剂盒v3IlluminaMS-102-3003

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
研究参与者
ART持续时间(平均22年)及病毒抑制状态
阅读提示:Methods 'Study participants' 部分
静息CD4+ T细胞分离
分离方法及试剂
阅读提示:Methods 'Resting CD4+ T cell isolation' 部分
QVOA
PHA浓度、IL-2浓度、培养时间、MOLT-4/CCR5细胞
阅读提示:Methods 'Quantitative viral outgrowth assay (QVOA)' 部分
IPDA
DNA提取方法、IPDA试剂盒
阅读提示:Methods 'Intact proviral DNA assay (IPDA)' 部分
测序分析
env引物、PCR条件、测序平台
阅读提示:Methods 'Sequencing of viral isolates and proviruses in resting CD4+ T cells' 部分