研究参与者队列建立
纳入长期ART且病毒抑制良好的HIV-1感染者。
从多个诊所招募42名长期ART(平均22年)的感染者,通过临床记录确认病毒抑制。
The latent reservoir of inducible, infectious HIV-1 does not decrease despite decades of antiretroviral therapy
研究包含体外实验(QVOA、IPDA)、患者样本(42例长期ART感染者)及纵向分析,并进行了功能验证(病毒诱导)和机制验证(克隆增殖,高clonality)。
42例长期ART的HIV-1感染者 静息CD4+ T细胞 MOLT-4/CCR5细胞系
供体的ART持续时间(平均22年)及血浆病毒载量抑制情况 QVOA中使用的PHA浓度(0.5 μg/mL)和IL-2浓度(100 U/mL) IPDA检测的完整原病毒频率
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
纳入长期ART且病毒抑制良好的HIV-1感染者。
从多个诊所招募42名长期ART(平均22年)的感染者,通过临床记录确认病毒抑制。
获取用于储存库检测的静息CD4+ T细胞。
通过ficoll梯度离心和阴性选择分离静息CD4+ T细胞。
定量检测可诱导的、具有复制能力的病毒频率。
使用极限稀释培养法,通过PHA和IL-2激活静息CD4+ T细胞,与MOLT-4/CCR5细胞共培养,检测p24抗原。
定量检测遗传完整的原病毒频率并与QVOA结果比较。
提取静息CD4+ T细胞基因组DNA,使用IPDA试剂盒检测原病毒的完整性和缺失类型。
评估病毒克隆性,判断是否由细胞增殖维持。
对QVOA阳性孔的上清液病毒RNA和静息CD4+ T细胞的原病毒DNA进行env单基因组测序,构建系统发育树。
分析储存库随时间的变化模式。
使用混合效应模型拟合QVOA和IPDA数据,评估指数衰减、分段指数衰减或双指数模型。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | EasySep人CD4+ T细胞富集试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| CD25微珠II | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| CD69微珠试剂盒II | Miltenyi Biotec | 130-092-355 | |
| 抗HLA-DR微珠 | Miltenyi Biotec | 130-046-101 | |
| QVOA | 植物血凝素 | -- | -- |
| MOLT-4/CCR5细胞系 | American Type Culture Collection | -- | |
| 白细胞介素-2 | -- | -- | |
| p24抗原ELISA | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IPDA | QIAamp DNA迷你试剂盒 | Qiagen | 51306 |
| 病毒RNA分离 | 96孔离心板 | Zymo Research | R1041 |
| cDNA合成 | RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂 | Invitrogen | 10777019 |
| SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080044 | |
| 测序 | Gentra Puregene试剂盒 | Qiagen | 158043 |
| plexWell 384 | seqWell | PW384 | |
| MiSeq试剂盒v3 | Illumina | MS-102-3003 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 研究参与者 | ART持续时间(平均22年)及病毒抑制状态 阅读提示:Methods 'Study participants' 部分 |
| 静息CD4+ T细胞分离 | 分离方法及试剂 阅读提示:Methods 'Resting CD4+ T cell isolation' 部分 |
| QVOA | PHA浓度、IL-2浓度、培养时间、MOLT-4/CCR5细胞 阅读提示:Methods 'Quantitative viral outgrowth assay (QVOA)' 部分 |
| IPDA | DNA提取方法、IPDA试剂盒 阅读提示:Methods 'Intact proviral DNA assay (IPDA)' 部分 |
| 测序分析 | env引物、PCR条件、测序平台 阅读提示:Methods 'Sequencing of viral isolates and proviruses in resting CD4+ T cells' 部分 |