筛选Dach1为足细胞损伤易感基因
从大规模插入突变筛选鉴定能使损伤抵抗性足细胞变得易感的基因。
对遗传背景不同的永生化足细胞系进行HIV感染和软琼脂集落形成实验，发现Dach1位点插入突变导致Dach1表达降低，并使原本抵抗的FVB/N;Cast/Ei足细胞形成集落。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
DACH1保护足细胞免受实验性糖尿病损伤并调控PTIP-H3K4Me3活性
DACH1 protects podocytes from experimental diabetic injury and modulates PTIP-H3K4Me3 activity
实验完整度
高包含人类样本、全身和足细胞特异性敲除小鼠、诱导性过表达小鼠、体外足细胞系、转录组学及机制验证（Co-IP、ChIP-qPCR等）
主要模型
足细胞特异性Dach1敲除小鼠 诱导性足细胞特异性DACH1过表达小鼠（podocin-rtTA; TRE-Dach1） OVE26糖尿病小鼠 人永生化足细胞系 293T细胞 人肾组织样本（DKD患者和对照）
重点核对
STZ诱导糖尿病模型中STZ剂量（50 μg/g/d，腹腔注射，连续5天） 足细胞特异性Dach1敲除小鼠在STZ诱导糖尿病后1个月出现严重蛋白尿和FSGS 阿霉素肾病模型中ADR剂量（20 mg/kg，静脉注射） DACH1过表达小鼠实验中多西环素饮食（625 mg/kg饲料）从断奶开始持续给予 ChIP-qPCR中使用的细胞数量（293T细胞1.5×10^7，人足细胞6×10^7）
摘要
Dachshund同源物1（DACH1）是关键的细胞命运决定因子，通过DNA序列特异性结合调控转录。我们在一个大规模筛选中发现Dach1表达降低，该筛选旨在寻找使损伤抵抗性足细胞转化为损伤易感性足细胞的突变。在糖尿病肾病（DKD）患者中，足细胞DACH1表达水平降低，且与不良临床结局密切相关。全身性Dach1敲除小鼠表现为肾发育不全并在围产期死亡。然而，足细胞特异性Dach1敲除小鼠在基线时维持正常的肾小球结构，但在糖尿病发病后迅速出现足细胞损伤。此外，小鼠足细胞特异性增强DACH1表达可保护免受DKD。结合RNA测序和计算机启动子分析，发现足细胞特异性Dach1和Pax反式激活结构域相互作用蛋白（Ptip）敲除小鼠的肾小球转录组特征呈相反重叠，上调基因的启动子中DACH1结合位点数量高于预期。PTIP是激活型组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4Me3）复合物的必需组分，它与DACH1相互作用，并被DACH1招募至其启动子结合位点。DACH1-PTIP招募抑制转录并降低启动子H3K4Me3水平。足细胞中DACH1敲低联合高血糖触发靶基因上调和启动子H3K4Me3增加。这些发现表明，在DKD中，DACH1表达的降低通过其靶基因的表观遗传去抑制增强了足细胞损伤易感性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 足细胞DACH1表达降低在糖尿病肾病发病中的作用及其机制。
- 核心机制
- DACH1通过其DNA结合域招募PTIP至靶基因启动子，降低H3K4Me3水平并抑制转录；在DKD中，DACH1表达降低导致PTIP招募减少，启动子H3K4Me3水平升高，靶基因去抑制，增加足细胞损伤易感性。
- 主要证据
- 足细胞特异性Dach1敲除小鼠在糖尿病后出现严重足细胞损伤；DACH1过表达保护OVE26小鼠；RNA-seq和启动子分析鉴定DACH1靶基因；Co-IP和ChIP-qPCR证明DACH1-PTIP相互作用及对H3K4Me3的调控。
- 研究意义
- 增强足细胞DACH1活性可同时纠正多个失调信号通路，为DKD药物开发提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人类DKD样本中DACH1表达分析
验证DACH1在人类DKD足细胞中表达是否降低及其与临床指标的相关性。
利用Nephroseq数据库分析DKD患者肾小球转录组数据，并用免疫荧光检测DKD患者肾组织DACH1蛋白水平，分析其与蛋白尿和EGFR的相关性。
构建并分析全身及足细胞特异性Dach1敲除小鼠
明确Dach1在肾脏发育和足细胞损伤中的作用。
使用“knockout first”技术生成Dach1敲除小鼠，观察全身敲除小鼠的肾表型；生成足细胞特异性敲除小鼠，并在STZ诱导糖尿病后评估肾损伤。
足细胞DACH1过表达对DKD的保护作用
验证增强足细胞DACH1表达是否足以减缓DKD进展。
利用podocin-rtTA; TRE-Dach1转基因小鼠与OVE26糖尿病小鼠杂交，给予多西环素饮食诱导DACH1表达，分析蛋白尿、肾组织学变化和足细胞形态。
鉴定DACH1直接转录靶基因
结合转录组和计算机启动子分析鉴定足细胞中DACH1的直接靶基因。
对足细胞特异性Dach1敲除小鼠和对照小鼠的肾小球进行RNA-seq，并与Ptip敲除小鼠的差异表达基因重叠，通过启动子分析寻找DACH1结合位点。
验证DACH1-PTIP相互作用及其对转录的调控
证明DACH1与PTIP相互作用并调控靶基因启动子H3K4Me3水平。
在293T细胞中进行Co-IP验证蛋白相互作用；利用荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR检测DACH1对转录的抑制及对H3K4Me3水平的影响。
验证DACH1敲低联合高血糖对靶基因的调控
模拟DKD中DACH1降低和高血糖条件，验证对靶基因表达及H3K4Me3的影响。
在人足细胞中稳定敲低DACH1，在高糖条件下检测靶基因NELL2、NTRK3、PAMR1、MYCL1的表达和启动子H3K4Me3水平。
验证DACH1序列特异性DNA结合对转录抑制的必要性
证实DACH1直接结合靶基因启动子是其介导转录抑制所必需的。
构建NELL2启动子及ΔDBD缺失突变体报告基因，转入DACH1过表达或对照足细胞，检测荧光素酶活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 糖尿病诱导 | 链脲佐菌素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 阿霉素肾病诱导 | 阿霉素 | -- | -- |
| DACH1诱导表达 | 多西环素盐酸盐 | Envigo | -- |
| 染色质免疫沉淀 | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technologies | 9003 |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | MilliporeSigma | M8823 |
| 荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 转录组测序 | RNeasy微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 反转录 | Superscript IV逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白质印迹 | PTIP抗体 | MilliporeSigma | ABE1877 |
| 染色质免疫沉淀 | H3K4Me3抗体 | Cell Signaling Technologies | 9751 |
| 免疫荧光 | DACH1抗体 | MilliporeSigma | HPA012672 |
| 蛋白质印迹 | DACH1抗体 | Proteintech | 10914-1-AP |
| 免疫荧光 | NELL2抗体 | MilliporeSigma | HPA035715 |
| 免疫共沉淀 | FLAG标签抗体 | MilliporeSigma | F1804 |
| V5标签抗体 | MilliporeSigma | V8137 | |
| 蛋白质印迹 | GAPDH抗体 | Cell Signaling Technologies | clone |
| 免疫荧光 | WT1抗体 | Abcam | ab89901 |
| 免疫组织化学 | Ki67抗体 | Cell Signaling Technologies | 12202 |
| 转染 | PTIP-FLAG质粒 | Genscript | OHU18275D |
| 报告基因 | pGL3-control载体 | Promega | -- |
| pcDNA3.1载体 | Genscript | -- | |
| LVR-1048载体 | Cellomics Technology | -- | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 转染 | 脂质体转染试剂 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96 AQueous One Solution细胞增殖检测试剂盒 | Promega | G4000 |
| 显微镜 | JEOL 1011透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| Hitachi S430场发射扫描电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| 图像分析 | MetaMorph软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 糖尿病小鼠模型（STZ） | STZ剂量（50 μg/g/d，腹腔注射，连续5天）；小鼠周龄（8周）；糖尿病确认血糖>300 mg/dl；处死时间（糖尿病后1个月）；对照组注射溶剂。 阅读提示：方法“Diabetes mouse models” |
| DACH1过表达小鼠实验 | 多西环素饮食浓度（625 mg/kg饲料）及开始时间（断奶后）和持续时间（至处死）；OVE26小鼠背景；24小时尿收集在14周龄进行。 阅读提示：方法“Diabetes mouse models” |
| 阿霉素肾病模型 | ADR剂量（20 mg/kg，静脉注射）；观察时间（2周后处死）。 阅读提示：方法“ADR nephropathy” |
| 染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR） | 细胞数量（293T: 1.5×10^7；足细胞: 6×10^7）；染色质片段大小（250-1000 bp）。 阅读提示：方法“ChIP-qPCR” |
| 足细胞培养和处理 | 培养条件（33°C增殖，37°C分化）；高糖浓度（文中未明确具体浓度，需查阅补充方法或原始文献）；甘露醇对照。 阅读提示：方法“Podocyte cell culture”和“DACH1 knockdown podocytes” |