患者样本中RAB7表达分析
评估PAH患者肺组织和PAECs中RAB7的表达水平。
通过免疫荧光和免疫印迹检测PAH患者和对照组肺组织、PAECs和PASMCs中RAB7蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
RAB7缺陷损害肺动脉内皮功能并促进肺动脉高压
RAB7 deficiency impairs pulmonary artery endothelial function and promotes pulmonary hypertension
实验完整度
高包括患者样本、细胞模型、小鼠模型和大鼠模型，并包含功能验证（血管生成、迁移、衰老）和机制验证（自噬、线粒体功能）及药物干预实验。
主要模型
人肺动脉内皮细胞（PAECs） 内皮RAB7单倍剂量不足小鼠（RAB7fl/WT Cdh5-Cre+） 慢性缺氧/SU5416（Hx/Su）诱导的肺动脉高压大鼠模型
重点核对
患者PAECs中RAB7表达降低及内体-溶酶体功能受损 内皮RAB7单倍剂量不足小鼠在常氧下自发PH，暴露于Hx/Su后加重 RAB7 siRNA敲低PAECs中血管生成、迁移和衰老的表型变化 RAB7敲低导致线粒体膜电位降低、氧化磷酸化受损和糖酵解增强 ML-098干预治疗可减轻已建立的Hx/Su大鼠的PH和右心功能障碍
摘要
肺动脉高压（PAH）是一种毁灭性的进行性疾病，治疗选择有限。内皮功能障碍在PAH的发生和发展中起核心作用，但其潜在机制尚不完全清楚。内体-溶酶体系统对维持细胞健康至关重要，小GTP酶RAB7调节该系统的许多功能。在此，我们探讨了RAB7在内皮细胞（EC）功能和肺血管稳态中的作用。我们发现PAH患者EC中RAB7表达降低。内皮RAB7单倍剂量不足导致小鼠自发性肺动脉高压（PH）。EC中RAB7沉默通过RNA-Seq揭示了基因表达的广泛变化，RAB7沉默的EC表现出血管生成受损和衰老细胞比例扩大，同时伴有内体-溶酶体运输和降解受损，提示自噬在降解前水平受到抑制。此外，线粒体膜电位和氧化磷酸化降低，糖酵解增强。用RAB7激活剂ML-098治疗可减轻慢性缺氧/SU5416诱导的大鼠已建立的PH。总之，我们首次证明了RAB7缺失导致EC功能根本性损伤，从而引起PH，并表明RAB7激活可能是PH临床前模型中的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内皮RAB7缺乏是否导致内皮功能障碍并促进肺动脉高压，以及RAB7激活是否具有治疗潜力？
- 核心机制
- 内皮RAB7缺乏通过抑制自噬（降解前水平）、损害内体-溶酶体运输和降解，导致线粒体功能障碍（ΔΨm降低、氧化磷酸化受损、糖酵解增强和ROS产生增加），促进内皮衰老和功能障碍，进而促进肺血管重塑和PH。
- 主要证据
- 患者PAECs中RAB7表达降低；内皮RAB7单倍剂量不足小鼠自发性PH；RAB7敲低体外实验显示血管生成受损、衰老增加、内体-溶酶体功能受损、线粒体膜电位和氧化磷酸化降低；ML-098在Hx/Su大鼠中逆转已建立的PH。
- 研究意义
- 该研究首次证明RAB7在内皮细胞功能和肺血管稳态中的根本作用，并表明RAB7激活可能是PAH的潜在治疗策略，为现有治疗提供补充。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内内皮RAB7单倍剂量不足小鼠模型
检测内皮RAB7单倍剂量不足对肺血管重塑和PH发展的影响。
通过RAB7fl/fl与Cdh5-Cre杂交产生内皮特异性RAB7单倍剂量不足小鼠，暴露于Hx/Su或常氧，评估PH参数。
体外RAB7敲低功能实验
评估RAB7沉默对人PAECs功能的影响。
使用siRNA沉默PAECs中RAB7，进行血管生成、迁移、衰老、内体-溶酶体运输和降解、线粒体功能等检测。
ML-098药物干预实验
评估RAB7激动剂ML-098对Hx/Su诱导的PH大鼠的治疗效果。
采用预防性（day1-21）和干预性/逆转性（day22-35或day36-49）给药方案，评估ML-098对PH参数的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮细胞生长培养基-2微血管 | Lonza | CC-3162 |
| 平滑肌细胞生长培养基2 | Lonza | CC-3182 | |
| siRNA转染 | GenMute转染试剂 | SignaGen | SL100568 |
| RAB7 siRNA | Integrated DNA Technologies | NM_004637 | |
| 对照siRNA | Integrated DNA Technologies | 51-01-14-04 | |
| 血管生成实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| μ-slide 15孔培养皿 | Ibidi | 81506 | |
| 细胞迁移实验 | 3孔迁移实验培养插入件 | Ibidi | 80369 |
| 衰老检测 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9860 |
| 内体-溶酶体运输检测 | pHrodo红色葡聚糖 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | P10361 |
| CellLight早期内体-GFP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10586 | |
| LysoTracker绿色荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| 溶酶体活性检测 | 组织蛋白酶B检测试剂盒 | PromoCell | PK-CA577-K140 |
| 线粒体膜电位检测 | TMRE染色试剂盒 | Abcam | ab113852 |
| MitoTracker绿色荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| TMRM检测试剂盒 | Abcam | ab228569 | |
| Hoechst 33342染料 | Thermo Fisher Scientific | H-1399 | |
| 线粒体ROS检测 | mitoSOX红色探针 | Thermo Fisher Scientific | M36008 |
| LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34975 | |
| 乳酸检测 | 乳酸-Glo检测 | Promega | J5021 |
| 动物实验 | SU5416 | MilliporeSigma | S8442 |
| ML-098 | TargetMol | T4619 | |
| Vevo 2100小动物超声成像系统 | VisualSonics | -- | |
| GE Vivid IQ Premium超声系统 | GE Healthcare | -- | |
| 1.4F Millar导管 | Millar | -- | |
| PowerLab数据采集系统 | AD Instruments | -- | |
| 小动物呼吸机（RoVent） | Kent Scientific Corporation | -- | |
| 显微镜 | EVOS M7000自动显微镜 | Thermo Fisher Scientific | AMF7000 |
| 流式细胞术 | BD FACSSymphony A1流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo 10软件 | FlowJo | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.0软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本分析 | 患者和对照组的样本量、PAECs分离和培养条件、RAB7表达检测方法 阅读提示：Methods: Cell lines, Tissue samples; Figure 1 legends |
| 内皮RAB7单倍剂量不足小鼠模型 | 小鼠品系、Cre介导的重组、Hx/Su暴露方案、PH评估指标和方法 阅读提示：Methods: Animal models, Animal experiments; Figure 2 legends |
| 体外RAB7敲低实验 | siRNA序列和浓度、转染试剂、转染时间、功能实验条件（血管生成、迁移、衰老等） 阅读提示：Methods: Cell culture experiments; Figure 4 and 5 legends |
| 线粒体功能检测 | TMRE/MitoTracker染色浓度和孵育时间、Seahorse分析条件、乳酸检测方法 阅读提示：Methods: Cell culture experiments; Figure 6 legends |
| ML-098治疗实验 | ML-098剂量和给药方案、动物模型建立和监测、PH评估指标 阅读提示：Methods: Animal experiments; Figure 7 and 8 legends |