发现FMO2在缺血性心肌细胞中表达上调
鉴定与心肌细胞缺血损伤相关的关键基因
对常氧和低氧处理的新生大鼠心肌细胞进行RNA-Seq分析，发现FMO2是氧化还原过程中表达上调最显著的基因之一；随后在MI大鼠心肌细胞和患者心脏样本中验证FMO2表达增加。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
含黄素单加氧酶2通过其二硫键催化活性在缺血模型中赋予心脏保护作用
Flavin-containing monooxygenase 2 confers cardioprotection in ischemia models through its disulfide bond catalytic activity
实验完整度
高包含细胞实验（NRCMs、hiPSC-CMs）、动物模型（MI和I/R大鼠模型、FMO2-KO大鼠）、临床样本、RNA-Seq、蛋白互作及结构模拟等多种证据层级，且具有明确的功能验证和机制验证。
主要模型
新生大鼠心肌细胞（NRCMs） 成年大鼠心肌梗死模型 大鼠心肌缺血/再灌注模型 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）
重点核对
SD大鼠（3-8周龄）通过尾静脉注射AAV9-shFMO2或AAV9-FMO2（4×10^12病毒颗粒/只），4周后建立MI模型 NRCMs在低氧（0.5% O2）条件下处理24或48小时 FMO2-KO大鼠通过CRISPR/Cas9基因编辑构建 TUNEL和cleaved caspase 3检测心肌细胞凋亡 使用DTNB和TCEP检测二硫键形成
摘要
心肌梗死（MI）的特征是大量心肌细胞（CM）死亡和心脏功能障碍，有效的保护性治疗手段亟待开发。在此，我们报道在离体和在体缺血损伤模型中，心肌细胞中的含黄素单加氧酶2（FMO2）水平显著升高。FMO2的基因缺失导致心肌细胞存活率降低和心脏功能障碍加重，而心肌细胞特异性FMO2过表达在梗死大鼠心脏中发挥保护作用。机制上，FMO2通过下调未折叠蛋白反应通路，抑制内质网应激诱导的凋亡蛋白（包括caspase 12和C/EBP同源蛋白（CHOP））的激活。进一步，我们鉴定FMO2为一个分子伴侣，通过其GVSG基序催化未折叠和错误折叠蛋白中的二硫键形成。GVSG突变的FMO2无法催化二硫键形成，并失去了对内质网应激和心肌细胞死亡的保护作用。最后，我们在人诱导多能干细胞来源的心肌细胞模型中证实了FMO2的保护作用。总之，本研究突出FMO2作为心肌细胞氧化性蛋白折叠的关键调节因子，并强调其在治疗缺血性心脏病中的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FMO2在心肌缺血损伤中是否对心肌细胞具有保护作用，其作用机制是什么？
- 核心机制
- FMO2通过其GVSG基序催化未折叠蛋白的二硫键形成，促进氧化性蛋白折叠，从而抑制未折叠蛋白反应（UPR）通路，减少内质网应激诱导的凋亡蛋白（如CHOP和caspase 12）的激活，最终抑制心肌细胞凋亡并改善心脏功能。
- 主要证据
- 在NRCMs和hiPSC-CMs中，FMO2过表达减少低氧诱导的凋亡，而敲低或突变GVSG基序则消除保护作用；在MI大鼠模型中，CM特异性FMO2过表达改善心脏功能，而敲低则恶化；体外实验证明FMO2催化GSH和肽底物中二硫键的形成。
- 研究意义
- FMO2是心肌细胞氧化性蛋白折叠的关键调节因子，具有治疗缺血性心脏病的潜力，可能成为心肌梗死和心力衰竭的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FMO2在心肌细胞凋亡和心脏功能中的功能
阐明FMO2对心肌细胞存活和心脏功能的影响
通过AAV9介导的心肌细胞特异性敲低和过表达FMO2，以及FMO2基因敲除大鼠，观察MI后心肌细胞凋亡、梗死面积和心脏功能的变化。
探索FMO2调控内质网应激和UPR通路的机制
明确FMO2是否通过调节内质网应激和UPR通路影响心肌细胞凋亡
在低氧处理的心肌细胞中检测内质网应激标志物和UPR通路蛋白的表达，评估FMO2敲低或过表达对UPR的影响；并通过CHOP过表达验证其关键作用。
揭示FMO2催化二硫键形成的生化活性
证明FMO2具有催化二硫键形成的能力
通过DTNB检测细胞硫醇含量、DTT诱导的细胞毒性实验、体外GSH氧化实验和荧光肽底物实验，验证FMO2的催化活性；并使用TCEP和PDI敲低实验验证其与ER应激的关系。
确定FMO2中负责二硫键形成的GVSG基序
鉴定FMO2催化活性所需的关键结构基序
通过结构比对和分子动力学模拟，预测GVSG基序的关键作用；构建GVSG突变体（LV-ΔFMO2）并在细胞和动物模型中验证其功能丧失。
在体内模型中验证FMO2的治疗潜力
评估FMO2过表达对心肌梗死和缺血再灌注损伤的治疗效果
在MI和I/R大鼠模型中，通过AAV9介导的FMO2过表达或敲低，评估其对心功能、心肌凋亡、纤维化和内质网应激的影响；并在hiPSC-CMs中验证人FMO2的保护作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | AAV9-shFMO2 | -- | -- |
| AAV9-FMO2 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Genomcellbio Biotechnology | -- | |
| II型胶原酶 | Gibco | -- | |
| 明胶 | MilliporeSigma | -- | |
| 5-溴-2-脱氧尿苷 | MilliporeSigma | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FMO2抗体 | Novus Biologicals | NBP1-85952 | |
| FMO1抗体 | Abcam | ab97720 | |
| FMO3抗体 | Abcam | ab126711 | |
| FMO4抗体 | Abcam | ab191141 | |
| FMO5抗体 | Abcam | ab189516 | |
| 心肌肌钙蛋白I抗体 | Abcam | ab47003 | |
| FLAG标签抗体 | Abcam | ab49763 | |
| cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| GRP78抗体 | Abcam | ab21685 | |
| caspase 12抗体 | MilliporeSigma | C7611 | |
| CHOP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7351 | |
| p-PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3179 | |
| PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3192 | |
| p-eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9721 | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 5324 | |
| ATF6抗体 | Proteintech | 24169 | |
| sXBP1抗体 | BioLegend | 619502 | |
| PDI抗体 | Cell Signaling Technology | 3501 | |
| HIF1抗体 | Huabio | ER1802-41 | |
| 肌动蛋白抗体 | Kangchen | KC-5A08 | |
| ECL化学发光检测试剂盒 | MilliporeSigma | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| MMLV逆转录酶 | TAKARA | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | Takara | -- | |
| 组织切片染色 | 30%蔗糖溶液 | Sangon Biotech | -- |
| OCT包埋剂 | Sakura | -- | |
| 小麦胚芽凝集素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 肌钙蛋白I抗体（免疫荧光用） | Abcam | ab47003 | |
| 山羊抗兔二抗 | Abcam | ab96883 | |
| Masson三色染色试剂盒 | Solaribio | -- | |
| 凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | Roche | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| TruSeq PE簇生成试剂盒 | Illumina | -- | |
| 透射电镜 | 醋酸铀酰 | -- | -- |
| H-7500透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0037 |
| 二硫键测定 | 总硫醇检测试剂盒 | BestBio | -- |
| 谷胱甘肽 | MilliporeSigma | -- | |
| 体外酶活反应 | 纯化FMO2蛋白 | Sino Biological | -- |
| 多肽NRCSQGSCWN | Chinese Peptide | -- | |
| 蛋白质氧化还原状态检测 | AMS（4-乙酰氨基-4'-马来酰亚胺基芪-2,2'-二磺酸） | Invitrogen | -- |
| NEM（N-乙基马来酰亚胺） | MilliporeSigma | -- | |
| TCEP（三(2-羧乙基)膦） | Sangon Biotech | -- | |
| hiPSC培养 | mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | -- |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| Accutase消化液 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Y27632（ROCK抑制剂） | Tocris | -- | |
| hiPSC分化 | CHIR99021（GSK3抑制剂） | Selleckchem | -- |
| 无胰岛素RPMI/B-27培养基 | -- | -- | |
| IWP2（Wnt抑制剂） | Biorbyt | -- | |
| 流式细胞术 | True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | -- |
| PE标记小鼠抗肌钙蛋白T抗体 | BD Biosciences | 564767 | |
| BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 心肌梗死后FMO2的表达检测 | 成人SD大鼠（3-8周龄）MI术后3天分离CM；NRCMs低氧处理24或48小时；FMO2蛋白和mRNA水平；FMO1-5表达情况 阅读提示：Methods: Animals, MI and I/R models, Western blot analysis, RT-qPCR; Results: Figure 1 |
| AAV9介导的FMO2敲低/过表达 | AAV9-shFMO2或AAV9-FMO2的注射剂量（4×10^12病毒颗粒/只）和给药途径（尾静脉）；注射后4周进行MI手术；心肌细胞特异性启动子cTnT 阅读提示：Methods: AAV9 construction and injection; Results: Figure 2 and Figure 3 |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL染色定量（TUNEL+和troponin I+双阳性细胞数）；cleaved caspase 3蛋白表达；样本数量（每组n=5） 阅读提示：Methods: TUNEL assay; Results: Figure 2 A-D |
| 内质网应激和UPR通路检测 | 低氧处理NRCMs（24小时）或MI后第3天心脏组织；检测GRP78、CHOP、cleaved caspase 12、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、sXBP1、ATF6蛋白水平 阅读提示：Methods: Western blot analysis; Results: Figure 5 and Figure 6 |
| 二硫键催化活性检测 | DTNB法测定细胞硫醇含量；DTT处理（5 mM，4小时）后CCK-8检测细胞活力；FMO2蛋白浓度（3 μM）和底物（GSH、肽NRCSQGSCWN）反应体系；TCEP（0.5 mM）处理；PDI siRNA敲低 阅读提示：Methods: Thiol-disulfide exchange reactions, Determination of the thiol group, DTT-induced reductive stress model, Results: Figure 7 |
| GVSG基序功能验证 | LV-ΔFMO2（GVSG突变）的构建和表达；在低氧NRCMs中检测二硫键含量、TUNEL凋亡、ER应激相关蛋白表达 阅读提示：Methods: Lentivirus construction and transfection; Results: Figure 8 |
| 大鼠心肌缺血/再灌注模型 | I/R手术操作：左前降支结扎45分钟后松开；AAV9-shFMO2或AAV9-FMO2注射后4周进行I/R手术；再灌注后4小时和28天检测 阅读提示：Methods: MI and I/R models; Results: Supplemental Figure 13-14 |
| hiPSC-CMs模型验证 | hiPSC-CMs分化流程和鉴定；低氧处理条件；FMO2过表达或敲低后检测GRP78、CHOP等ER应激蛋白 阅读提示：Methods: Generation of CMs from hiPSCs, Characterization of hiPSC-CMs; Results: Supplemental Figure 15 |