验证TRIM28作为E2F1靶基因
探究E2F1是否直接调控TRIM28表达
通过CUT&RUN-seq、ChIP-PCR、shRNA敲低和过表达实验，在多种CRPC细胞系中验证E2F1对TRIM28的转录调控。
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RSK1驱动的TRIM28/E2F1正反馈环路促进去势抵抗性前列腺癌进展
RSK1-driven TRIM28/E2F1 feedback loop promotes castration-resistant prostate cancer progression
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植瘤模型、患者样本分析及组学数据等多层级验证，并明确功能验证和机制验证。
主要模型
C4-2B细胞 DU145细胞 LNCaP细胞 22Rv1细胞 LuCaP 145.1 PDX模型 Pb-Cre:Pten–/–小鼠来源的类器官
重点核对
E2F1与TRIM28的表达相关性 TRIM28 S473磷酸化状态 RSK1激酶活性 Rb（RB1）状态 RSK抑制剂（BI-D1870、LJH685）的处理效果
摘要
去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是前列腺癌（PCa）的晚期致死阶段。TRIM28，又称KAP1，是一种转录调节因子，近期被发现可促进CRPC细胞增殖和异种移植瘤生长。然而，关于TRIM28在CRPC中上调的机制以及TRIM28调控的基因组靶点的知识缺口仍然存在。在此，我们报道TRIM28是CRPC中E2F1的靶基因。通过整合基因组方法，我们证明了TRIM28形成一个正反馈环路，以不依赖于视网膜母细胞瘤（Rb）状态的方式促进E2F1的转录激活和基因组功能。此外，我们确定RSK1是一种直接磷酸化TRIM28 S473位点的激酶，因此，RSK1驱动TRIM28/E2F1正反馈环路。相应地，pS473-TRIM28促进CRPC进展，而RSK抑制可减缓这一进程。总之，我们的研究揭示了RSK1–TRIM28–E2F1轴在CRPC进展中的关键作用，该轴可能作为治疗Rb缺陷型CRPC的脆弱性靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM28在CRPC中上调的机制及其调控的基因组靶点是什么？
- 核心机制
- RSK1直接磷酸化TRIM28 S473，驱动TRIM28/E2F1正反馈环路，促进E2F1转录激活，不依赖AR和Rb状态。
- 主要证据
- 通过CUT&RUN-seq、ChIP-PCR、RNA-seq、ATAC-seq、体内异种移植瘤模型及临床样本IHC染色等实验证明。
- 研究意义
- 揭示RSK1–TRIM28–E2F1轴可能作为Rb缺陷型CRPC的治疗脆弱性靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
揭示TRIM28对E2F通路的调控
确定TRIM28是否调控E2F通路及具体机制
通过RNA-seq、qPCR、免疫印迹和CUT&RUN-seq分析TRIM28敲低或过表达对E2F1及其靶基因的影响。
探究pS473-TRIM28的功能
验证TRIM28 S473磷酸化对E2F1转录激活的作用
通过表达TRIM28野生型及S473A/S473D、S824A/S824D突变体，分析它们对E2F1表达、染色质可及性和组蛋白修饰的影响。
鉴定TRIM28 S473激酶
寻找并验证直接磷酸化TRIM28 S473的激酶
通过共免疫沉淀、GST pull-down、体外激酶实验，验证RSK1与TRIM28的相互作用及磷酸化。
验证pS473-TRIM28在CRPC进展中的作用
评估pS473-TRIM28对CRPC细胞增殖和体内肿瘤生长的影响
通过集落形成、细胞增殖实验和异种移植瘤模型，比较TRIM28野生型与S473A突变体的功能差异。
评估RSK抑制剂效果
验证RSK抑制剂对pS473-TRIM28及肿瘤生长的抑制效果
使用RSK抑制剂（BI-D1870、LJH685）处理细胞和动物模型，检测pS473-TRIM28水平、细胞增殖和肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| RPMI1640培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 青霉素链霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| 药物处理 | G418 | Targetmol | T6512 |
| Ulixertinib | Targetmol | T7005 | |
| BI-D1870 | Targetmol | T6171 | |
| 帕博西尼 | Targetmol | T6239 | |
| LJH685 | Targetmol | T6877 | |
| Western blot | 抗KAP1抗体 | Abcam | ab10483 |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| P90RSK兔多克隆抗体 | ABclonal | A15718 | |
| 磷酸化RPS6KA1-T573兔多克隆抗体 | ABclonal | AP1103 | |
| KAP1/TRIM28兔多克隆抗体 | ABclonal | A2245 | |
| 纯化的抗TIF1-β (KAP-1, TRIM28) 磷酸化 (Ser473) 抗体 | Biolegend | 654102 | |
| 磷酸化KAP-1 (Ser824) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4127 | |
| E2F-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3742 | |
| HA标签 (C29F4) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| Myc标签 (71D10) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) 抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Rb (4H1) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| 兔来源抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小鼠来源抗FLAG M2单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | -- | |
| E2F1抗体 (KH95) | Santa Cruz | -- | |
| GST抗体 (B-14) | Santa Cruz | -- | |
| α-tubulin抗体 (B-7) | Santa Cruz | -- | |
| 分子克隆 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | -- |
| X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | Polyscience | 23966 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Takara | -- |
| RT-qPCR | ReverTra Ace qPCR RT Master Mix试剂盒 | Toyobo | -- |
| 2xBullseye EvaGreen qPCR MasterMix | MIDSCI | -- | |
| Quantum 3实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | 文中未明确说明 | -- |
| 文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4603 | |
| Illumina Nova-seq测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫共沉淀 | Surebeads Protein G磁珠 | Biorad | -- |
| 体外激酶实验 | 重组活性RSK1 | Active Motif | 81398 |
| γ-32P ATP | PerkinElmer | NEG002A250UC | |
| ATP | Cell Signaling Technology | 9804 | |
| 细胞增殖实验 | WST-1试剂盒 | Clontech | -- |
| CUT&RUN-seq | 刀豆蛋白A包被磁珠 | 文中未明确说明 | -- |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | 文中未明确说明 | -- | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Diagenode | -- |
| 洋地黄皂苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DNA清洁与浓缩-5试剂盒 | ZYMO Research | -- | |
| 免疫荧光 | FITC偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 |
| TRITC偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| DAPI | 文中未明确说明 | -- | |
| Prolong Gold抗淬灭剂 | Invitrogen | -- | |
| Nikon Eclipse Ti2荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| IHC | ImmPRESS HRP Universal PLUS Polymer试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| H&E染色试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| VectaMount AQ水溶性封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| Nikon Upright 80I显微镜 | Nikon | -- | |
| 类器官培养 | II型胶原酶 | Life Technologies | 17101-015 |
| Advanced DMEM-F12培养基 | Life Technologies | 12634-34 | |
| Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | |
| TrypLE Express消化液 | Life Technologies | 12605-010 | |
| 基质胶 | BD | 356231 | |
| Primocin抗生素 | 文中未明确说明 | -- | |
| Glutamax补充剂 | 文中未明确说明 | -- | |
| B27补充剂 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型、FBS浓度、抗生素浓度 阅读提示：Methods: Cell lines and chemical reagents |
| 基因敲低/敲除 | shRNA靶序列、转染/感染试剂、转导条件（如polybrene浓度）、敲除效率验证 阅读提示：Methods: DNA constructs, transfection, and lentiviral infection |
| 表达分析 | RNA提取方法、反转录试剂、qPCR引物、内参基因（GAPDH）、免疫印迹抗体及稀释比例 阅读提示：Methods: RNA isolation, quantitative RT-PCR, and RNA sequencing; Antibodies |
| CUT&RUN-seq | 细胞数量、抗体种类及用量、酶消化时间、文库制备试剂盒 阅读提示：Methods: CUT&RUN-seq |
| 体内实验 | 动物品系（NSG）、细胞接种数量、肿瘤体积测量方法、给药剂量及途径（palbociclib, BI-D1870） 阅读提示：Methods: Cell-line derived xenograft and Patient-derived xenograft Models |
| 类器官培养 | 组织来源、消化条件、Matrigel浓度、培养基成分、Rb敲低方法 阅读提示：Methods: Organoid generation |