人类CD相关基因的染色质可及性分析
探究PRC1是否参与调控CD相关基因网络
对人类Treg进行ATAC-Seq，分析CD-DEGs相关区域的开放染色质，并通过ReMap与ENCODE ChIP-Seq数据交叉参考，识别PRC1成员富集。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
BMI1维持Treg表观基因组景观以预防炎症性肠病
BMI1 maintains the Treg epigenomic landscape to prevent inflammatory bowel disease
实验完整度
高包含人类Treg ATAC-Seq、ChIP-Seq、siRNA敲低、条件性基因敲除小鼠、T细胞转移结肠炎模型等多层级验证。
主要模型
Jurkat T细胞系（E6-1） 小鼠FOXP3+调节性T细胞（BMI1条件性敲除） T细胞转移结肠炎模型（RAG-1缺陷小鼠） 人类CD相关CD4+ T细胞
重点核对
BMI1条件性敲除小鼠（Foxp3-Cre × Bmi1-flox） PTC209 BMI1抑制剂处理Jurkat细胞 T细胞转移结肠炎模型中Treg共转移 ATAC-Seq和ChIP-Seq分析条件 血清细胞因子检测
摘要
FOXP3+ Tregs在人类克罗恩病的炎症肠道中扩增，然而这些细胞中FOXP3介导的基因抑制却丧失。多梳抑制复合物在FOXP3靶基因调控中发挥作用，但更深入的机制见解尚不完整。我们现在特别鉴定了多梳抑制复合物1（PRC1）家族成员BMI1在人类和小鼠Tregs中调控促炎增强子网络中的作用。利用人类Tregs和固有层T细胞，我们通过染色质可及性分析推断PRC1调控克罗恩病相关基因网络。小鼠FOXP3+细胞中条件性缺失BMI1导致全身性炎症。通过全基因组转录、染色质可及性和蛋白质组学技术评估，BMI1缺陷的Tregs呈现TH1/TH17样表型。最后，BMI1突变体FOXP3+细胞在人类炎症性肠病的过继转移模型中不能抑制结肠炎。我们提出，BMI1在体内和体外强制执行Treg身份中发挥重要作用。通过遗传或瞬时BMI1耗竭导致的Treg身份丧失会扰乱表观基因组，并将Tregs转化为Th1/Th17样促炎细胞，这一转变与人类克罗恩病相关的CD4+ T细胞有关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PRC1家族成员BMI1在Treg表观基因组调控和炎症性肠病发病中的作用是什么？
- 核心机制
- BMI1通过维持染色质可及性和组蛋白修饰（如H3K27ac）来抑制促炎基因网络（如Th1/Th17相关基因），其缺失导致Treg身份丧失并转化为促炎细胞。
- 主要证据
- 人类Treg ATAC-Seq和ChIP-Seq揭示PRC1相关开放染色质；小鼠条件性敲除BMI1导致Treg呈现Th1/Th17样表型和自发性结肠炎；BMI1缺陷Treg在过继转移模型中不能抑制结肠炎。
- 研究意义
- BMI1在维持Treg身份和抑制结肠炎中起关键作用，其功能障碍可能参与人类克罗恩病，并为靶向BMI1的癌症治疗提供免疫学考虑。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PRC1靶基因富集分析
验证PRC1靶基因在CD相关差异表达基因中的富集
将已发表的PRC1靶基因列表与CD-DEGs比较，进行富集分析和通路分析。
BMI1敲低对组蛋白修饰的影响
探究BMI1在人类淋巴细胞中是否具有PRC2非依赖的功能
在Jurkat细胞中通过siRNA敲低BMI1或EZH2，进行ChIP-Seq检测H3K27me3和H3K27ac。
BMI1表达和蛋白相互作用检测
验证BMI1在Treg中特异性表达并与RING1B形成复合物
通过Western blot检测BMI1和MEL18表达，原位邻位连接技术检测BMI1-RING1B相互作用。
BMI1抑制对IL-2表达的影响
探讨BMI1是否抑制IL-2等PRC2靶基因
用PTC209抑制BMI1，检测细胞中IL-2表达和H2AK119ub水平。
条件性敲除小鼠的免疫表型分析
评估体内BMI1缺失对免疫系统的影响
生成Foxp3-Cre;Bmi1-flox小鼠，分析外周血CD4+ T细胞、血清细胞因子、结肠组织病理。
BMI1缺陷Treg的转录组和表观基因组分析
鉴定BMI1缺陷Treg中差异表达基因和开放染色质区域
分选脾脏Treg，进行microarray和ATAC-Seq，并进行通路和motif分析。
BMI1缺陷Treg的体外功能检测
测试BMI1缺陷Treg是否呈现促炎表型
分离Treg并刺激，检测培养上清中的细胞因子。
过继转移结肠炎模型
评估BMI1缺陷Treg在体内抑制结肠炎的能力
将CD45RBhi T细胞和WT或BMI1 KO Treg共转移至RAG-1缺陷小鼠，监测体重、疾病活动指数、组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和转染 | Jurkat T细胞系（E6-1克隆） | ATCC | TIB-152 |
| CD4+ T细胞分离 | CD4+CD62L+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-106-643 |
| Treg分离 | CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-041 |
| 人类CD4+ T细胞分离 | CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-533 |
| CD45RA微珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-901 | |
| 固有层CD4+ T细胞分离 | CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-155 |
| Treg分化 | 抗CD3抗体 | BD BioSciences | 555329 |
| 抗CD28抗体 | BD BioSciences | 555725 | |
| 白细胞介素-2 | Peprotech | 200-02 | |
| 转化生长因子-β | Peprotech | 100-21C | |
| 细胞因子分析 | BD微球阵列小鼠Th1/Th2/Th17试剂盒 | BD Bioscience | 560485 |
| 免疫印迹 | 抗Bmi1抗体 | Cell Signaling Technology | 5756 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 抗Mel18抗体 | Abcam | ab5267 | |
| 抗H2A泛素化抗体 | Cell Signaling Technology | 8240 | |
| 抗H2A抗体 | Cell Signaling Technology | 3636 | |
| RNA提取 | RNeasy小提试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| cDNA合成 | SuperScript III第一链试剂盒 | Invitrogen | -- |
| qPCR | Express SYBR Green ER定量PCR超级预混液 | Invitrogen | -- |
| microarray | SABioscience小鼠Th细胞分化通路聚焦PCR芯片 | QIAGEN | -- |
| RNA保护 | RNA保护液 | QIAGEN | 76526 |
| RNA提取 | RNAeasy微量试剂盒 | QIAGEN | 74004 |
| 流式细胞术 | 抗小鼠FOXP3 Alexa Fluor 647抗体 | BioLegend | 320014 |
| 抗大鼠IgG AF647抗体 | BioLegend | 400526 | |
| 抗小鼠CD44 PE/Cy7抗体 | BioLegend | 104418 | |
| 抗叙利亚仓鼠IgG PE/Cy7抗体 | BioLegend | 400921 | |
| 抗人IL-2 AF647抗体 | BioLegend | 500315 | |
| 抗小鼠CD62L PE/Cy7抗体 | BioLegend | 104418 | |
| True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 | |
| siRNA转染 | ON-TARGETplus人BMI1 siRNA (648) | Dharmacon | L-005230-01-0005 |
| ON-TARGETplus人EZH2 siRNA (2146) | Dharmacon | L-004218-00-0005 | |
| ChIP-seq | 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 |
| 抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733S | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| Ovation Ultralow DR多重系统 | NuGen | -- | |
| 测序 | Illumina HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- |
| ATAC-seq | 片段分析仪 | Advanced Analytical Technologies | -- |
| 高灵敏度NGS片段分析试剂盒 | Advanced Analytical Technologies | DNF-486 | |
| 测序 | Illumina HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- |
| 动物模型 | FOXP3-CRE小鼠 | Jackson Laboratory | -- |
| C57BL/6J小鼠 | -- | -- | |
| C57BL/6J RAG-1小鼠 | -- | -- | |
| 流式细胞术分选 | FACS Aria流式分选仪 | BD Biosciences | -- |
| qPCR仪 | Bio-Rad CFX96实时PCR仪 | Bio-Rad | -- |
| 数据统计 | GraphPad软件8.0版 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人类Treg分化 | 细胞因子浓度（IL-2 10ng/mL, TGF-β 5ng/mL），培养时间7天 阅读提示：Methods: Differentiation of human primary T cells |
| BMI1敲低 | siRNA浓度（BMI1 120nM, EZH2 100nM），电穿孔条件（315mV, 10ms） 阅读提示：Methods: Transfection of Jurkat cells |
| 条件性敲除小鼠 | 小鼠品系和年龄（6-21周龄），基因型 阅读提示：Methods: Mouse strains |
| T细胞转移结肠炎模型 | 细胞数量（5×10^5 CD45RBhi，1.5×10^5 Treg），注射途径（腹腔），观察时间9周 阅读提示：Methods: T cell transfer model of chronic colitis |
| ATAC-seq | 细胞数量（50,000），测序平台（HiSeq 4000） 阅读提示：Methods: ATAC-seq |
| ChIP-seq | 抗体（H3K27ac, H3K27me3），测序平台（HiSeq 2000） 阅读提示：Methods: ChIP-seq |