jck小鼠肾表型表征
验证jck小鼠作为PKD模型的适用性，评估细胞增殖、凋亡、纤维化等表型特征。
对1至4月龄jck小鼠肾脏进行组织学分析，检测AQP2表达、Ki-67、CDK1、MYC、凋亡标志物及纤维化标志物。
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SCF-SKP2 E3泛素连接酶将mTORC1/ER应激/ISR与小鼠肾囊肿发生中的YAP激活联系起来
SCF-SKP2 E3 ubiquitin ligase links mTORC1/ER stress/ISR with YAP activation in murine renal cystogenesis
实验完整度
高包含遗传模型（eIF2α S52A敲入杂交）、体外细胞模型（MDCKII囊性结构、脱纤毛）、动物药理学干预（TUDCA、托伐普坦、SKPin C1）及Pkd1缺失模型，并有YAP泛素化、靶基因表达和肾功能等机制和功能验证。
主要模型
jck小鼠（Nek8jck/jck） MDCKII细胞（forskolin诱导的囊性结构模型） eIF2α S52A敲入杂交小鼠（jckeIF2α+/SA） Pkd1条件敲除小鼠（Pkd1condPax8Tet-On）
重点核对
jck小鼠模型为Nek8 jck/jck（C57/BL6J背景），仅分析雄性小鼠 eIF2α S52A敲入小鼠为杂合子（+/SA），与jck杂交产生四种基因型 TUDCA以0.2% wt/wt混入饲料，托伐普坦以0.1% wt/wt混入饲料，从1月龄开始给药2个月 SKPin C1以单次腹腔注射20 mg/kg给药1周 MDCKII细胞用forskolin（10 μM）刺激14天诱导囊性结构，TUDCA处理评估ER应激缓解作用
摘要
Hippo通路核效应因子Yes相关蛋白（YAP）增强由纤毛病引起的多囊肾病（PKD）的进展。PKD中YAP表达和转录活性增加的机制仍不清楚。我们观察到，在患有幼年囊性肾病（jck）纤毛病的小鼠肾脏中，由ERK1/2和PI3K/AKT级联驱动的机械性靶点雷帕霉素复合物1（mTORC1）的异常过度活跃诱导了ER蛋白毒性应激。为了通过重编程翻译来减轻这种应激，整合应激反应（ISR）的蛋白激酶R样内质网激酶-真核起始因子2α（PERK/eIF2α）臂被激活。PERK介导的eIF2α磷酸化驱动激活转录因子4（ATF4）的选择性翻译，增强YAP表达。同时，YAP经历SCF S期激酶相关蛋白2（SKP2）E3泛素连接酶的K63连接多聚泛素化，这是一种不依赖Hippo的非蛋白水解性泛素化，可增强癌细胞中YAP的核转运和转录活性。在eIF2α磷酸化缺陷的jck小鼠中，ISR对ER应激的细胞适应缺陷进一步增强了YAP介导的转录活性和肾囊肿生长。相反，通过给予牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）或托伐普坦在药理学上调低ER应激/ISR活性和SKP2表达，可阻碍这些过程。恢复ER稳态和/或干扰SKP2-YAP相互作用代表了阻止肾囊肿发生进展的潜在治疗途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在jck小鼠肾囊肿发生中，mTORC1/ER应激/ISR通路如何促进YAP表达和转录活性，以及其分子机制和潜在治疗策略是什么？
- 核心机制
- mTORC1过度活跃诱导ER应激，激活PERK/eIF2α/ATF4轴，ATF4促进YAP表达；同时SCF-SKP2 E3泛素连接酶对YAP进行K63连接的非蛋白水解性多聚泛素化，增强YAP核转位和转录活性，从而促进肾囊肿生长。
- 主要证据
- 在jck小鼠肾脏中检测到mTOR、ERK、AKT磷酸化增强，ER应激标志物GRP78、ATF4、CHOP升高，YAP表达和核定位增加，K63-泛素化YAP增加；eIF2α S52A敲入加重囊肿，TUDCA或托伐普坦治疗降低YAP和SKP2表达并减缓囊肿生长。
- 研究意义
- 恢复ER稳态或干扰SKP2-YAP相互作用可能成为阻止纤毛病相关囊性肾病进展的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
mTOR/ER应激/ISR通路激活验证
检测jck肾脏中mTOR、ERK、AKT通路及ER应激/ISR标志物的表达变化。
通过Western blot和IHC检测p-ERK1/2、p-AKT、p-mTOR、p-EIF4EBP1、p-RPS6、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP的表达。
YAP/TAZ表达及转录活性评估
验证YAP/TAZ表达增加及其转录活性增强。
检测YAP/TAZ总蛋白和磷酸化水平，免疫组化定位，以及下游靶基因Cyr61和Ctgf的表达。
eIF2α S52A突变对肾囊肿发生的影响
通过遗传学方法验证eIF2α磷酸化在囊肿发生中的作用。
将eIF2α S52A敲入小鼠与jck小鼠杂交，产生四种基因型，通过超声和病理分析评估囊肿负担。
YAP K63-泛素化及SKP2表达分析
探究YAP K63多聚泛素化是否参与其激活，并检测SKP2表达。
免疫沉淀和Western blot检测YAP K63和K48泛素化，免疫荧光共定位，检测SKP2和p27表达。
体外脱纤毛模型评估
验证纤毛缺失是否诱导ER应激和YAP激活。
使用MDCKII细胞和MEFs，通过氯醛水合物处理脱纤毛，检测信号通路和YAP定位。
体外囊肿模型药理学干预
评估TUDCA和verporfin对forskolin诱导的囊肿形成的影响。
MDCKII细胞用forskolin（10 μM）培养14天诱导囊肿，分别加入verporfin（1 μM）或TUDCA，分析囊肿数量、YAP定位和靶基因表达。
体内药物干预
评估TUDCA和托伐普坦对jck小鼠肾囊肿生长的治疗效果。
从1月龄起，jck小鼠分别给予含TUDCA或托伐普坦的饲料2个月，通过超声、组织学及分子生物学评估效果。
SKP2抑制剂的效应评估
验证SKP2抑制是否通过恢复p27表达和降低YAP活性影响囊肿发生。
给jck小鼠注射SKPin C1，1周后检测p27、YAP表达。
Pkd1缺失模型中的验证
验证SKP2表达增加在Pkd1缺失模型中是否重现，表明普遍性。
使用他莫昔芬诱导的肾脏上皮特异性Pkd1敲除小鼠（EO和LO），检测YAP、p-mTOR、CYR61和SKP2表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | jck小鼠 | The Jackson Laboratory | stock no. 002561 |
| 细胞培养 | MDCKII细胞 | -- | -- |
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | -- | -- | |
| 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | 毛喉素 | BioShop Canada | -- |
| 精氨酸加压素 | MilliporeSigma | -- | |
| 维替泊芬 | -- | -- | |
| 牛磺熊去氧胆酸 | Best of Chemicals Sciences (USA) | -- | |
| 托伐普坦 | Best of Chemicals Sciences (USA) | -- | |
| SKPin C1 | Selleckchem | S8652 | |
| 水合氯醛 | -- | -- | |
| Western blot | ATF4抗体 | Proteintech | 10835-1-AP |
| SKP2抗体 | Proteintech | 15010-1-AP | |
| CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| p-YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 | |
| YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| p27抗体 | Cell Signaling Technology | 3686 | |
| MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 9402 | |
| p-RPS6抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 | |
| t-RPS6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| p-mTORC1抗体 | Cell Signaling Technology | 5536 | |
| t-mTORC1抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| p-ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| t-eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 2103 | |
| p-AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| t-AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| EIF4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| K48-泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 8081 | |
| p-PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3179 | |
| PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3192 | |
| CYR61抗体 | Elabscience Biotechnology | E-AB-14920 | |
| CTGF抗体 | Elabscience Biotechnology | E-AB-12339 | |
| 水通道蛋白2抗体 | Elabscience Biotechnology | E-AB-30540 | |
| CDK1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-54 | |
| t-ERK1/2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-94 | |
| α-微管蛋白抗体 | MilliporeSigma | T5168 | |
| K63-泛素抗体 | MilliporeSigma | 05-1308 | |
| PCNA抗体 | Thermo Fisher Scientific | MS-106-P1ABX | |
| p-LATS1/2抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-64591 | |
| Oct4抗体 | Novus Biologicals | NB100-2379 | |
| Sox2抗体 | Abcam | ab97959 | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| Ki-67抗体 | Abcam | SP6 | |
| p-eIF2α抗体 | Abcam | ab32157 | |
| BIM抗体 | Abcam | ab32158 | |
| TAZ抗体 | Abcam | ab224239 | |
| GRP78抗体 | StressMarq Biosciences | A0241 | |
| 巢蛋白1抗体 | DSHBU Iowa | rat-401s | |
| 免疫荧光 | YAP-Alexa Fluor 594抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271134 |
| Ub-K63-Alexa Fluor 488抗体 | Abcam | ab192539 | |
| 显微成像 | LSM 800激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| Volocity图像分析软件 | Volocity USA | version 6.5.1 | |
| 动物实验 | 2018啮齿动物实验室饲料 | Harlan | -- |
| 羟丙基纤维素 | -- | -- | |
| Teklad饲料粉 | Envigo | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | jck小鼠（Nek8jck/jck）的遗传背景、性别（仅雄性）、饲养条件 阅读提示：Methods：Mice and genotyping |
| eIF2α S52A敲入小鼠杂交 | eIF2α S52A敲入小鼠的基因型（杂合子）、杂交策略及基因分型引物 阅读提示：Methods：Generation of jck eIF2α+/SA mice |
| 体外MDCKII细胞囊性模型 | 细胞系（MDCKII）、forskolin浓度（10 μM）、处理时间（14天）、TUDCA浓度范围、verteporfin浓度（1 μM） 阅读提示：Results：YAP inhibition impairs cystogenesis in an in vitro model；Supplemental Methods |
| 脱纤毛处理 | 氯醛水合物浓度（递增，最高4 mM）、处理时间 阅读提示：Results：Deciliation increases ER stress and YAP activity |
| 药物体内给药 | TUDCA和托伐普坦的给药剂量（0.2% wt/wt和0.1% wt/wt）、给药周期（2个月）、给药方式（混入饲料，周期给药：连续4天给药后3天停药） 阅读提示：Methods：Treatment of jck mice with TUDCA or tolvaptan |
| SKP2抑制剂处理 | SKPin C1的剂量（20 mg/kg）、给药方式（单次腹腔注射）、处理时间（1周） 阅读提示：Methods：Peptides and chemicals |
| 分子检测 | 抗体及其稀释度、IP/WB条件、RT-qPCR引物和条件 阅读提示：Methods：Antibodies；Supplemental Methods |
| 统计分析 | 样本量（n）、统计方法（t检验、ANOVA）、显著性阈值（P < 0.05） 阅读提示：Methods：Statistics |