体外DNA-PK抑制对黑色素瘤抗原表达的影响
验证DNA-PK抑制能否改变黑色素瘤细胞的肿瘤抗原表达谱并诱导新抗原产生。
用NU7441处理B16-F10和MB3429细胞，通过RNA-Seq、RT-PCR和Western blot检测黑色素瘤相关抗原及新抗原的表达变化，并鉴定新抗原。
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DNA-PK抑制增强新抗原多样性并增加对免疫抵抗性肿瘤的T细胞应答
DNA-PK inhibition enhances neoantigen diversity and increases T cell responses to immunoresistant tumors
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠荷瘤模型、人肿瘤样本与TIL共培养、临床队列数据分析等多个独立证据层级，并有功能验证与机制验证。
主要模型
B16-F10小鼠黑色素瘤细胞系 C57BL/6小鼠皮下荷瘤模型 人黑色素瘤细胞系MB3429及配对TIL TCGA黑色素瘤患者队列
重点核对
DNA-PK抑制剂NU7441的给药剂量（0.125 mg/只/次）和给药方案（腹腔注射，每日两次，持续5天） STING激动剂DMXAA的给药剂量（50 μg/只）和给药途径（瘤内注射） 抗CD40抗体给药剂量（100 μg/只）和给药途径（腹腔注射） B16-F10肿瘤细胞接种数量（2×10^5） CD8+ T细胞耗竭抗体的给药时机和剂量（100 μg/只，于SL40注射前4天和2天）
摘要
有效的抗肿瘤T细胞活性依赖于肿瘤新抗原的表达和MHC呈递。肿瘤细胞可通过沉默抗原转录或改变MHC机制来逃避T细胞检测，导致新抗原特异性T细胞活化不足。我们鉴定出DNA依赖性蛋白激酶抑制剂（DNA-PKi）NU7441是一种有前景的免疫调节剂，它在一组人黑色素瘤细胞系中减少免疫抑制蛋白，同时增加MHC-I表达。在荷瘤小鼠中，使用NU7441与免疫佐剂干扰素基因刺激因子（STING）配体和CD40激动剂NU-SL40的联合治疗显著增加并多样化了新抗原景观、抗原呈递机制，并因此显著增加了新抗原反应性肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的数量和库容。DNA-PK抑制或敲除促进了人和小鼠黑色素瘤中多种新抗原的转录和蛋白表达，并在抵抗性肿瘤中诱导了对免疫检查点阻断（ICB）的敏感性。在患者中，蛋白激酶DNA激活催化亚基（PRKDC）转录水平与MHC-I表达和CD8+ TIL呈负相关，但与增加的新抗原负荷和改善的ICB应答呈正相关。这些研究表明，抑制DNA-PK活性可以通过增加新抗原表达和呈递以及拓宽新抗原反应性T细胞群体来恢复肿瘤免疫原性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抑制DNA-PK能否通过增加肿瘤新抗原的表达与呈递来增强肿瘤免疫原性，并协同免疫佐剂克服免疫抵抗性肿瘤对T细胞免疫和检查点阻断的不应答？
- 核心机制
- DNA-PK抑制通过转录调控增加肿瘤相关抗原和多种新抗原的表达与多样性，促进MHC-I表达和抗原呈递，从而拓宽新抗原反应性T细胞库并增强其效应功能，恢复肿瘤免疫原性。
- 主要证据
- 在B16-F10小鼠模型中使用NU7441联合STING激动剂和抗CD40（NU-SL40）治疗，显着增加CD8+ TIL浸润、活化及TCRvβ多样性，并诱导肿瘤消退；在人黑色素瘤细胞中，NU7441增加TAA和新抗原表达，并增强自体TIL杀伤；PRKDC突变患者具有更高TMB和新抗原负荷及更好ICB应答。
- 研究意义
- 该研究提出DNA-PK抑制可作为免疫调节策略，与检查点阻断联合用于新抗原负荷低的肿瘤（如葡萄膜、黏膜和肢端黑色素瘤）的治疗，并建议PRKDC表达或突变状态可作为ICB疗效的潜在预测生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NU-SL40联合治疗对荷瘤小鼠的疗效评估
评估DNA-PK抑制联合免疫佐剂对免疫抵抗性B16-F10黑色素瘤的治疗效果及对CD8+ T细胞的依赖。
在C57BL/6小鼠皮下接种B16-F10细胞，待肿瘤生长至约25 mm²后给予NU7441、STING激动剂（DMXAA）和抗CD40抗体联合治疗，监测肿瘤生长和生存期，并通过CD8+ T细胞耗竭验证其依赖。
肿瘤微环境转录组分析
探索NU-SL40治疗引起的肿瘤微环境基因表达变化，特别是与抗原呈递、炎症信号和T细胞募集相关的通路。
用NanoString PanCancer IO 360 Panel对治疗和未治疗小鼠肿瘤RNA进行分析，比较基因表达差异并进行通路分析。
肿瘤浸润免疫细胞表型分析
评估NU-SL40治疗对肿瘤浸润淋巴细胞亚群数量和功能表型的影响。
通过流式细胞术分析肿瘤浸润的CD8+ T、CD4+ T、NK、B细胞及髓系细胞的数量和表型，包括PD-1、4-1BB等活化标志物。
TCRvβ库多样性分析
检测NU-SL40治疗是否改变肿瘤浸润CD8+ T细胞的TCRvβ家族分布和多样性。
使用流式细胞术对CD8+ TILs进行15种TCRvβ链染色，比较不同治疗组间的TCRvβ家族分布，并评估功能相关的TCRvβ变化。
离体TIL功能验证
验证NU-SL40治疗诱导的CD8+ TIL对新抗原的应答能力及TCRvβ特异性。
从治疗和未治疗小鼠肿瘤中分离TIL，与表达串联微基因（TMG）的DC2.4细胞共培养，通过ELISA和流式细胞术检测IFN-γ和GzmB产生。
患者数据分析
探讨人黑色素瘤患者中PRKDC表达和突变与CD8+ T浸润、MHC-I表达及ICB治疗应答的关系。
分析TCGA和三个黑色素瘤ICB治疗临床试验的公开外显子组和RNA-seq数据，评估PRKDC表达与CD8a、HLA-A表达的相关性，以及PRKDC突变与TMB、新抗原负荷和ICB应答的关联。
DNA-PK敲除肿瘤对ICB的敏感性验证
验证肿瘤细胞在DNA-PK敲除后对免疫检查点阻断治疗的敏感性及其对长期免疫记忆的影响。
生成B16-F10 DNA-PK敲除细胞系，接种于小鼠，评价其对抗PD-1/CTLA-4联合抗CD40治疗的反应，并观察长期生存和肿瘤再攻击后的免疫记忆。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | B16-F10细胞 | ATCC | CRL-6475 |
| DC2.4细胞 | MilliporeSigma | 32011203 | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | MilliporeSigma | TMS-002-C | |
| 非必需氨基酸 | MilliporeSigma | TMS-001-C | |
| HEPES缓冲液 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| β-巯基乙醇 | MilliporeSigma | ES-007-E | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| 白细胞介素-2 | Proleukin, Aldesleukin | NDC | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 干扰素-γ | BioLegend | 575304 | |
| 药物处理 | NU7441 | SelleckChem; MedChemExpress | S2638-05; |
| STING激动剂（DMXAA） | InvivoGen | tlrl-dmx | |
| 抗CD40抗体 | Bio X Cell | BE0016-2 | |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 |
| 抗CD8耗竭抗体 | Bio X Cell | clone | |
| RNA提取 | RNeasy小提试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| NanoDrop One/OneC分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| TIL分离 | CD4、CD8（TIL）磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-116-480 |
| LS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 基因表达分析 | nCounter小鼠泛癌免疫肿瘤学360小组 | NanoString | XT-CS0-MIO360-12 |
| 免疫组织化学 | DNA-PK抗体 | Cell Signaling Technology | 12311 |
| 磷酸化DNA-PK抗体 | Abcam | ab18192 | |
| 新抗原鉴定 | Cell Line Nucleofector Kit L | Lonza | VCA-1005 |
| ELISA | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | BioLegend | 430804 |
| 流式细胞术 | Zombie Aqua活性染料 | BioLegend | 423102 |
| BV650标记抗CD3抗体 | BioLegend | 100229 | |
| Alexa Fluor 700标记抗CD4抗体 | BioLegend | 116022 | |
| APC-Cy7标记抗CD8抗体 | BioLegend | 100714 | |
| PE标记抗4-1BB抗体 | BioLegend | 106105 | |
| APC标记抗4-1BB抗体 | BioLegend | 106110 | |
| PE-Cy7标记抗PD-1抗体 | BioLegend | 135216 | |
| APC标记抗CD206抗体 | BioLegend | 141707 | |
| PE-Cy7标记抗F4/80抗体 | BioLegend | 123113 | |
| PerCp-Cy5.5标记抗CD38抗体 | BioLegend | 102722 | |
| BV421标记抗颗粒酶B抗体 | BioLegend | 396414 | |
| BV711标记抗CD107a抗体 | BioLegend | 121614 | |
| PerCP标记抗CD8a抗体 | BioLegend | 100732 | |
| PE标记抗TCRvβ6抗体 | BioLegend | 140004 | |
| PE标记抗TCRvβ8.3抗体 | BioLegend | 156304 | |
| PE-Cy7标记抗IFN-γ抗体 | BioLegend | 505826 | |
| BV785标记抗CD3抗体 | BioLegend | 100231 | |
| APC标记抗穿孔素抗体 | BioLegend | 154304 | |
| PerCp-Cy5.5标记抗TNF-α抗体 | BioLegend | 506322 | |
| APC/Fire-750标记抗CD45抗体 | BioLegend | 103153 | |
| FITC标记抗CD8α抗体 | BioLegend | 100803 | |
| BV605标记抗TCRγ/δ抗体 | BioLegend | 118129 | |
| PE标记抗CD20抗体 | BioLegend | 152105 | |
| APC标记抗NK1.1抗体 | BioLegend | 156505 | |
| APC/Fire-810标记抗F4/80抗体 | BioLegend | 123165 | |
| BV650标记抗GR-1抗体 | BioLegend | 108441 | |
| BV711标记抗CD206抗体 | BioLegend | 141727 | |
| PE-Cy7标记抗CD11b抗体 | BioLegend | 101215 | |
| PE/Dazzle-594标记抗CD11c抗体 | BioLegend | 117347 | |
| PerCP标记抗I-A/I-E抗体 | BioLegend | 107623 | |
| BV480标记抗TCRvβ9抗体 | BD Biosciences | 746449 | |
| BV480标记抗TCRvβ10[b]抗体 | BD Biosciences | 746729 | |
| BV650标记抗TCRvβ11抗体 | BD Biosciences | 743679 | |
| BV650标记抗TCRvβ13抗体 | BD Biosciences | 743993 | |
| BV711标记抗TCRvβ2抗体 | BD Biosciences | 745428 | |
| BV711标记抗TCRvβ3抗体 | BD Biosciences | 743416 | |
| BV785标记抗TCRvβ5.1,5.2抗体 | BD Biosciences | 743003 | |
| BV785标记抗TCRvβ8.1,8.2抗体 | BD Biosciences | 744334 | |
| FITC标记抗TCRvβ7抗体 | BD Biosciences | 553215 | |
| FITC标记抗TCRvβ14抗体 | BD Biosciences | 553258 | |
| BV480标记抗CD45.1抗体 | BD Biosciences | 746666 | |
| 抗Vβ FITC TCR试剂盒 | BD Biosciences | 557004 | |
| 细胞消化 | TURBO DNase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 |
| Liberase DH | MilliporeSigma | 5401054001 | |
| 血液收集 | LH锂肝素管 | Greiner Bio-One | 450477 |
| 血液处理 | 红细胞裂解液 | BioLegend | 420301 |
| 流式细胞术 | BD Cytofix/Cytoperm试剂盒（含GolgiStop） | BD | 554715 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外药物处理 | NU7441浓度（2 μM）和处理时间（48-72小时），细胞类型（B16-F10、MB3429） 阅读提示：需核对Methods中的细胞培养和药物处理部分 |
| 体内动物模型与治疗 | 小鼠品系（C57BL/6J）、周龄（8-10周）、性别、细胞接种量（2×10^5）、肿瘤大小（约25 mm²开始NU7441，约40 mm²时给予SL40）、NU7441剂量（0.125 mg/只/次）、给药途径（i.p.）和频率（每日两次，持续5天）、DMXAA剂量（50 μg/只）和途径（i.t.）、抗CD40剂量（100 μg/只）和途径（i.p.）、抗CD8耗竭抗体剂量（100 μg/只）及时间（SL40前4天和2天） 阅读提示：需核对Methods中的动物模型和药物处理部分 |
| NanoString基因表达分析 | RNA起始量（15 ng/μL）、使用的Panel（nCounter Mouse PanCancer IO 360 Panel）、分析软件（nSolver、ROSALIND） 阅读提示：需核对Methods中的NanoString基因表达部分 |
| TIL分离与共培养 | TIL分离方法（磁珠阳性选择）、TIL与B16-F10细胞比例（1:1）、共培养时间（20小时）、IFN-γ预处理浓度和时间（100 U/mL，24小时） 阅读提示：需核对Methods中的TIL分离和体外再刺激部分 |
| TMG实验 | DC2.4细胞的转染方法（nucleofection，2 μg质粒）、TIL与DC比例（10:1）、共培养时间（48小时，用于ELISA） 阅读提示：需核对Methods中的DC2.4 TMG质粒转染和离体TIL刺激部分 |
| 流式细胞术 | 抗体克隆、荧光染料、染色方案、固定破膜试剂盒（BD Cytofix/Cytoperm）、仪器（Cytek Aurora 3L）和分析软件（FlowJo） 阅读提示：需核对Methods中的抗体染色和流式细胞术部分以及补充方法 |
| 统计分析 | 统计方法（2-way ANOVA、t检验、Mann-Whitney U检验）、NanoString显著性标准（P < 0.05，FC > ±1.5） 阅读提示：需核对Methods中的统计部分 |