验证免疫细胞对心肌细胞的影响
确定压力超负荷心脏中招募的免疫细胞是否以及如何影响心肌细胞功能。
通过TAC模型研究CCR2+巨噬细胞积累，分离CCR2+巨噬细胞并与心肌细胞共培养，进行RNA测序和qRT-PCR分析IFN反应基因和ISG15表达。
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压力超负荷诱导ISG15促进不良心室重构并加重心力衰竭
Pressure overload induces ISG15 to facilitate adverse ventricular remodeling and promote heart failure
实验完整度
高包含体外细胞实验（原代心肌细胞、巨噬细胞条件培养基）、体内动物模型（TAC、Ang II、DOCA-salt、PAB）、人类样本验证、转录组学、蛋白质组学（diGLY）及代谢组学等多层级证据，并进行功能验证和机制探索。
主要模型
小鼠横向主动脉缩窄（TAC）模型 小鼠血管紧张素II输注模型 大鼠单侧肾切除DOCA-salt模型 大鼠肺动脉束带模型
重点核对
TAC手术后8周的心脏功能参数（射血分数、心输出量等） CCR2+巨噬细胞条件培养基诱导心肌细胞ISG15表达 心脏ISG15水平在Ifnar1-/-小鼠TAC后未升高 ISG15敲低后心肌细胞自噬标志物LC3-II增加 WT TAC心脏不溶性组分中细丝蛋白C积累
摘要
炎症促进不良心室重构，后者是心力衰竭的常见前兆。在此，我们试图确定炎症细胞如何影响重构心脏中的心肌细胞。致病性心脏巨噬细胞诱导心肌细胞产生干扰素（IFN）反应，其特征是泛素样蛋白IFN刺激基因15（ISG15）上调，该蛋白通过称为ISG化的过程对其靶蛋白进行翻译后修饰。心脏ISG15受I型IFN信号控制，且在小鼠横向主动脉缩窄或输注血管紧张素II、大鼠单侧肾切除加DOCA-salt或肺动脉束带、暴露于IFN或CD4+T细胞条件培养基的心肌细胞以及人类非缺血性心肌病的心室组织中，ISG15或ISG化均上调。通过纳米级液相色谱-串联质谱，我们鉴定出肌原纤维蛋白细丝蛋白C是ISG化的靶标。ISG15缺陷在小鼠横向主动脉缩窄模型中保持了心脏功能，并改善了离体小鼠心脏的恢复。代谢组学揭示ISG15调节心脏氨基酸代谢，而ISG15缺陷可防止错误折叠的细丝蛋白C积累并诱导心肌细胞自噬。总之，ISG15上调是病理性心室重构的一个特征，蛋白质ISG化是一种炎症诱导的翻译后修饰，可能通过改变心肌细胞蛋白质周转而促进心力衰竭的发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 压力超负荷诱导的心室重构中，免疫细胞如何影响心肌细胞功能，以及ISG15是否参与其中？
- 核心机制
- 压力超负荷诱导的I型IFN信号上调心肌细胞ISG15，通过ISG化修饰肌原纤维蛋白（如细丝蛋白C），导致其错误折叠和聚集，损害蛋白质周转和自噬，从而促进心脏功能障碍。
- 主要证据
- TAC小鼠心脏和人类NICM组织中ISG15上调；diGLY蛋白质组学鉴定细丝蛋白C为靶标；ISG15缺陷小鼠在TAC后保留心功能；ISG15缺陷改善离体心脏缺血/再灌注恢复；代谢组学显示氨基酸代谢改变；ISG15敲低诱导自噬。
- 研究意义
- 该研究将蛋白质ISG化确立为一种炎症驱动的翻译后修饰，在心室重构和应激条件下心脏功能调节中发挥重要作用，为心力衰竭的机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ISG15在压力超负荷模型中的表达
确认ISG15在多种压力超负荷模型和人类心力衰竭样本中是否上调，并确定其调节机制。
通过qRT-PCR、免疫印迹、RNAscope和免疫组化检测小鼠TAC、Ang II输注、大鼠DOCA-salt和PAB模型以及人类NICM样本中的ISG15表达；使用Ifnar1-/-小鼠验证I型IFN信号的作用。
鉴定ISG化靶标
识别压力超负荷心脏中ISG15的蛋白靶标，特别是肌原纤维蛋白。
使用diGLY蛋白质组学分析TAC小鼠心脏，结合Isg15-/-小鼠对照，筛选潜在ISG化底物；通过免疫共沉淀和共定位验证ISG15与细丝蛋白C的相互作用。
评估ISG15缺失对心脏功能的影响
确定ISG15缺失是否能改善压力超负荷或应激条件下的心脏功能。
对WT和Isg15-/-小鼠进行TAC手术，通过超声心动图评估心脏功能；进行离体Langendorff灌流实验，比较缺血/再灌注后的功能恢复。
探索ISG15影响心脏功能的机制
探究ISG15缺失导致心脏保护效应的潜在机制，特别是代谢和蛋白质质量控制。
对WT和Isg15-/-小鼠心脏进行非靶向代谢组学分析；通过免疫印迹检测细丝蛋白C的聚集和自噬标志物（LC3-II，p62）的变化；在体外验证ISG15敲低对自噬的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | Ccr2敲除小鼠 | The Jackson Laboratory | stock 004999 |
| Ccr2gfp/gfp敲入/敲除小鼠 | The Jackson Laboratory | stock 027619 | |
| Isg15敲除小鼠 | The Jackson Laboratory | stock 010486 | |
| Ifnar1敲除小鼠 | The Jackson Laboratory | stock 028288 | |
| C57BL/6J小鼠 | The Jackson Laboratory | stock 000664 | |
| CODA无创血压系统 | Kent Scientific | -- | |
| 超声心动图 | Vevo 2100小动物超声系统 | Visual Sonics Inc. | -- |
| 有创血流动力学监测 | 1.4F压力-容积导管 | AD Instruments | -- |
| MPVS Ultra数据采集系统 | AD Instruments | -- | |
| 药物处理 | 血管紧张素II | -- | -- |
| 脱氧皮质酮醋酸酯 | -- | -- | |
| Langendorff灌流 | Radnoti Langendorff恒压灌流装置 | AD Instruments | -- |
| RNAscope原位杂交 | RNAscope原位杂交试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗肌钙蛋白I抗体 | Abcam | ab47003 |
| Alexa Fluor 647标记驴抗兔二抗 | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| DAPI染料 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 显微镜成像 | Zeiss LSM 700共聚焦显微镜 | Carl Zeiss Canada | -- |
| 图像分析 | HALO图像分析平台 | Indica Labs | -- |
| 免疫组织化学 | 抗ISG15抗体（兔多克隆） | Thermo Fisher Scientific | PA5-88262 |
| 流式细胞术 | BD LSR Fortessa-X20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件 | FlowJo LLC | -- | |
| 细胞培养 | M199培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSAria III细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | (–)-Blebbistatin | Cayman Chemical | -- |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CD脂质 | MilliporeSigma | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞因子检测 | 小鼠细胞因子44-Plex检测试剂盒 | Eve Technologies | MECY2MAG-73K |
| ELISA | 高灵敏度IFN-α ELISA试剂盒 | PBL Assay Science | 42115-1 |
| RNA测序 | Illumina Novaseq 600测序仪 | Illumina | -- |
| qRT-PCR | High Capacity cDNA反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 巨噬细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | MilliporeSigma | M9170 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | SP6800索尼光谱分析仪 | Sony Biotechnology | -- |
| 巨噬细胞刺激 | 脂多糖 | MilliporeSigma | -- |
| poly(I:C)低分子量/LyoVec转染试剂 | InvivoGen | -- | |
| STING激动剂4 | MedChemExpress | HY-123943 | |
| ELISA | IFN-β ELISA试剂盒 | PBL Assay Science | 42410 |
| T细胞分离 | EasySep小鼠CD4+T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD4 (RM4-5)大鼠单克隆抗体 (PerCP-Cy5.5偶联) | Cell Signaling Technology | 49482 |
| 免疫印迹 | 抗ISG15抗体（小鼠） | Thermo Fisher Scientific | 703132 |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2188 | |
| 抗cGAS抗体 | Cell Signaling Technology | 31659 | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗RIG-I抗体 | Cell Signaling Technology | 3743 | |
| 抗MAVS抗体 | Cell Signaling Technology | 4983 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | MilliporeSigma | A1978 | |
| 抗细丝蛋白C抗体 | Novus Biologicals | NBP1-89300 | |
| 抗纽蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4650 | |
| 抗p62抗体 | Abcam | 109012 | |
| 抗LC3抗体 | Cell Signaling Technology | 12741 | |
| 人心肌细胞培养 | 人心肌细胞 | PromoCell | -- |
| 细胞处理 | 重组小鼠IFN-β | R&D Systems | -- |
| 重组小鼠IFN-α | R&D Systems | -- | |
| 重组IFN-β | R&D Systems | -- | |
| siRNA转染 | 靶向ISG15的siRNA | MilliporeSigma | -- |
| 阴性对照siRNA | MilliporeSigma | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein G磁珠 | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗细丝蛋白C抗体 | Cell Signaling Technology | 86972 | |
| 同型IgG | Abcam | ab172730 | |
| diGLY蛋白质组学 | Ultimate 3000纳升超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记AffiniPure Fab片段驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 711-547-003 |
| Alexa Fluor 648标记细丝蛋白C抗体 | Novus Biologicals | NBP2-79816AF647 | |
| 组织学 | 天狼星红染色 | -- | -- |
| 电子显微镜 | Hitachi HT7800透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 代谢组学 | Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Thermo Orbitrap QE+质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9软件 | GraphPad Software Inc. | -- |
| 图像分析 | ImageJ 1.39版软件 | NIH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TAC手术模型 | 小鼠品系、年龄（约8-12周）、性别（雄性）、TAC手术方法、术后时间点（1、4、8周） 阅读提示：Methods: Animal studies |
| CCR2+巨噬细胞条件培养基实验 | CCR2+巨噬细胞分离时间点（TAC后1周或4周）、细胞数量（3-4万）、培养时间（24小时）、心肌细胞处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Isolation of CCR2+ cardiac macrophages and exposure of cardiac myocytes to conditioned medium |
| IFN刺激实验 | IFN-β和IFN-α浓度（500 IU/mL）、处理时间（24-72小时）、poly(I:C)浓度 阅读提示：Methods: Adult mouse cardiomyocyte isolation; Human cardiac myocytes |
| 压力超负荷模型 | Ang II输注剂量（2 mg/kg/d）和时间（14天）、DOCA剂量（200 mg）和时间（4周）、PAB时间（6周） 阅读提示：Methods: Animal studies |
| 心脏功能评估 | TAC术后8周超声心动图参数（射血分数、心输出量等）、离体心脏缺血（20分钟）再灌注（40分钟）后LVDP恢复 阅读提示：Methods: Animal studies |
| ISG15缺失实验 | Isg15-/-小鼠品系、TAC术后8周心脏功能、离体心脏功能恢复 阅读提示：Results: ISG15 deficiency preserves LV function...; Figure 9 and Figure 10 |