RNAi 筛选鉴定 ODF2L
寻找影响 EOC 细胞对 WEE1 抑制敏感性的关键基因
使用靶向 263 个人类细胞周期相关基因的慢病毒 shRNA 文库感染 A2780 细胞，用亚致死剂量 AZD1775 处理，进行初筛和二次验证。
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ODF2L 是上皮性卵巢癌模型中 WEE1 抑制的合成致死伙伴
ODF2L acts as a synthetic lethal partner with WEE1 inhibition in epithelial ovarian cancer models
实验完整度
高包含 RNAi 筛选、体外细胞系功能实验、体内异种移植瘤及同系小鼠模型、患者来源样本及 PDX 模型等多层级验证，并明确机制验证。
主要模型
A2780、SKOV3、OV90、ES2 人卵巢癌细胞系 A2780 异种移植瘤模型 ID8-Luc 同系小鼠模型 患者来源的原代卵巢癌细胞及 PDX 模型
重点核对
筛选细胞系及 AZD1775 亚致死剂量（A2780、SKOV3 200 nM；OV90 1 μM；ES2 100 nM） ODF2L 敲低 shRNA 克隆及靶序列（#1: CCAGTGAAAGTCATCTCAGCT；#2: GCGGAGTTGGTAACTCATTCT） 体内模型给药方案：A2780 异种移植瘤 AZD1775 60 mg/kg 口服每日一次，共 7 天；敲低实验 40 mg/kg 每日一次；ID8 模型 30 mg/kg 每日一次 ODF2L 高/低表达患者原代细胞及 PDX 的分组依据（Western blot 验证） 细胞活力检测方法（CellTiter-Glo 发光法）及统计方法（1-way/2-way ANOVA 或 t 检验）
摘要
WEE1 已成为上皮性卵巢癌（EOC）中的一个有吸引力的靶点，但 EOC 细胞如何改变其对 WEE1 抑制的敏感性仍不清楚。在此，通过细胞周期机制相关基因的 RNAi 筛选，我们发现靶向精子尾部外致密纤维 2 样蛋白（ODF2L）是 EOC 细胞中 WEE1 激酶抑制的合成致死伙伴。敲低 ODF2L 在体外 EOC 细胞系以及体内异种移植瘤中显著增敏了细胞对 WEE1 抑制剂 AZD1775 的治疗。机制上，ODF2L 缺失时对 WEE1 抑制的敏感性增加伴随着 DNA 损伤的积累。ODF2L 许可 PKMYT1（WEE1 的功能冗余激酶）募集到 CDK1-cyclin B 复合物，从而在 WEE1 被抑制时限制 CDK1 的活性。临床上，ODF2L 的上调与患者来源的 EOC 细胞中 CDK1 活性、DNA 损伤水平和 WEE1 抑制的敏感性相关。此外，在 EOC 患者来源的异种移植瘤模型中，ODF2L 水平预测了对 WEE1 抑制的反应。肿瘤靶向脂质纳米颗粒包装 ODF2L siRNA 与 AZD1775 的联合治疗在 ID8 卵巢癌同系小鼠模型中导致肿瘤生长的协同衰减。这些数据表明，WEE1 抑制是针对低水平表达 ODF2L 的 EOC 细胞的一种有前景的精准治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EOC 细胞如何改变对 WEE1 抑制的敏感性，以及能否通过靶向特定基因增强其疗效？
- 核心机制
- ODF2L 作为支架蛋白，募集 PKMYT1 到 CDK1-cyclin B 复合物，促进 CDK1 的 Thr14 磷酸化，从而在 WEE1 抑制时限制 CDK1 活性，恢复 G2/M 检查点功能，介导对 WEE1 抑制的耐药。
- 主要证据
- RNAi 筛选鉴定 ODF2L，体外敲低增敏 AZD1775 并增加 DNA 损伤，体内异种移植及同系模型验证，机制上免疫共沉淀和 BRET 证明 ODF2L 与 PKMYT1/CDK1 的相互作用，患者来源细胞和 PDX 显示 ODF2L 水平与疗效相关。
- 研究意义
- ODF2L 可作为预测 WEE1 抑制剂疗效的标志物，并作为联合治疗的靶点，以提高敏感性、克服耐药并减少毒性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证 ODF2L 敲低增敏 AZD1775
验证 ODF2L 敲低是否影响 EOC 细胞对 AZD1775 的敏感性
在多种 EOC 细胞系中敲低 ODF2L，检测细胞活力、集落形成和凋亡。
体内验证 ODF2L 敲低增敏 AZD1775
验证 ODF2L 敲低能否增强 AZD1775 在体内的抗肿瘤效果
将敲低 ODF2L 的 A2780 细胞接种裸鼠，用 AZD1775 处理，监测肿瘤生长。
DNA 损伤和细胞周期分析
检测 ODF2L 敲低联合 AZD1775 对 DNA 损伤和细胞周期的影响
通过免疫荧光、碱性彗星实验、Western blot 检测 γH2AX、ATM/CHK2/RPA32 磷酸化，并用 EdU/Hoechst 染色分析细胞周期。
CDK1 活性检测和机制探索
阐明 ODF2L 调控 CDK1 活性的分子机制
检测 ODF2L 敲低或过表达后 CDK1 的激酶活性及 CDK1 磷酸化状态，并用 CDK1 抑制剂 Ro-3306 验证功能相关性。
蛋白相互作用和 BRET 验证
证明 ODF2L 介导 PKMYT1 与 CDK1 的相互作用
通过免疫共沉淀和 BRET 实验检测 ODF2L、PKMYT1 和 CDK1 之间的相互作用。
临床样本相关性分析和 PDX 验证
评估 ODF2L 表达水平与 AZD1775 敏感性在临床样本中的相关性
从 57 例卵巢癌患者组织分离原代 EOC 细胞，检测 ODF2L 表达、CDK1 活性和细胞活力；并将高/低 ODF2L 表达的 PDX 模型用 AZD1775 治疗。
靶向 ODF2L 的 LNP 联合治疗
评估靶向 ODF2L 的 RNAi 治疗与 AZD1775 联合在体内模型的疗效
使用 ASSET 平台制备包裹 siODF2L 的靶向 LNP，在 ID8-Luc 同系小鼠模型中与 AZD1775 联合治疗，监测肿瘤生长、生存期和机制标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640 培养基 | -- | -- |
| MCDB 105 培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Medium 199 培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| McCoy's 5a 培养基 | -- | -- | |
| DMEM 培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| GlutaMAX 添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | -- | -- | |
| II 型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 药物处理 | AZD1775 | Selleckchem | S1525 |
| Ro-3306 | MilliporeSigma | SML0569 | |
| 细胞同步化 | 胸苷 | MilliporeSigma | T1895 |
| 慢病毒包装 | 聚凝胺 | -- | -- |
| TransIT-LT1 转染试剂 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| DNA 损伤检测 | 彗星实验试剂盒 | Trevigen | 4250-050-K |
| SYBR Gold 核酸染料 | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| 细胞周期分析 | BeyoClick EdU-488 试剂盒 | -- | C0071 |
| Hoechst 33342 染料 | -- | -- | |
| 蛋白质印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| Qproteome FFPE 组织蛋白提取试剂盒 | QIAGEN | 37623 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- | |
| 增强化学发光底物 | -- | -- | |
| RNA 提取和 RT-qPCR | TRIzol 试剂 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- |
| NanoDrop ONE 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 反转录预混试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green 预混液 | Bio-Rad | -- | |
| Bio-Rad CFX 实时荧光定量 PCR 系统 | Bio-Rad | -- | |
| 质粒构建 | Q5 高保真 DNA 聚合酶 | -- | -- |
| pENTR/D-TOPO 载体 | -- | -- | |
| pLX302 载体 | -- | -- | |
| pLHCX 衍生 Gateway 目的载体 | -- | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | pET-53-DEST 载体 | -- | -- |
| pET-60-DEST 载体 | -- | -- | |
| LR Clonase II 重组酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BRET 检测 | Flexi 载体克隆系统 | Promega | -- |
| Nano-Glo 发光底物 | Promega | N1821 | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa 流式细胞仪 | BD | -- |
| 免疫荧光 | Zeiss 共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| LSM 710 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 抗体 | ODF2L 抗体 | Proteintech | 23887-1-AP |
| PKMYT1 抗体（用于免疫沉淀） | Thermo Fisher Scientific | A302-424A | |
| PKMYT1 抗体（用于免疫印迹） | Abnova | H00009088-B01P | |
| 磷酸化 ATM (Ser1981) 抗体 | Cell Signaling Technology | 5883 | |
| ATM 抗体 | Cell Signaling Technology | 2873 | |
| 磷酸化 CHK2 (Thr68) 抗体 | Cell Signaling Technology | 2197 | |
| CHK2 抗体 | Cell Signaling Technology | 6334 | |
| 磷酸化 RPA32/RPA2 S8 抗体 | Cell Signaling Technology | 83745 | |
| RPA32/RPA2 抗体 | Cell Signaling Technology | 35869 | |
| 磷酸化 CDK1 (Tyr15) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4539 | |
| 磷酸化 CDK1 T14 抗体 | Cell Signaling Technology | 2543 | |
| CDK1 抗体 | Cell Signaling Technology | 77055 | |
| 磷酸化组蛋白 γH2AX (Ser139) 抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| Alexa Fluor 594 偶联抗磷酸化组蛋白 γH2AX S139 抗体 | BioLegend | 613410 | |
| Alexa Fluor 488 偶联抗磷酸化组蛋白 γH2AX (Ser139) 抗体 | MilliporeSigma | 05-636-AF488 | |
| 磷酸化 PP1Cα T320 抗体 | Abcam | ab62334 | |
| FLAG 抗体 | MilliporeSigma | F1804/M2, F7425 | |
| GST 抗体 | MilliporeSigma | G1160/GST-2 | |
| Myc 标签抗体 | MilliporeSigma | 05-419 | |
| β-actin 抗体 | MilliporeSigma | A1978/AC-15 | |
| 抗小鼠 EGFR 抗体 | Novus Biologicals | NB600-724 | |
| 大鼠 IgG2a 同型对照 | Bio X Cell | BE0089 | |
| 脂质纳米颗粒制备 | MC3 (DLin-MC3-DMA) | Cayman Chemical | 34364 |
| 胆固醇 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| DSPC | Avanti Polar Lipids | -- | |
| DMG-PEG | Avanti Polar Lipids | -- | |
| DSPE-PEG | Avanti Polar Lipids | -- | |
| Nanoassemblr 微流控混合装置 | Precision Nanosystems | -- | |
| 动物实验 | 裸鼠 | Charles River Laboratories | -- |
| NOD SCIDγ 小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| C57BL/6 小鼠 | Charles River Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：A2780 和原代卵巢癌细胞用 RPMI 1640 + 10% FBS；OV90 用 MCDB 105/Medium 199 + 15% FBS；SKOV3 用 McCoy's 5a + 10% FBS；ES2 和 293T 用 DMEM + 10% FBS。所有细胞系需进行 STR 鉴定和支原体检测。 阅读提示：Methods: Cell culturing |
| 药物处理 | AZD1775 剂量：亚致死剂量因细胞系而异（A2780 和 SKOV3 为 200 nM，OV90 为 1 μM，ES2 为 100 nM）。体内实验剂量：A2780 异种移植瘤（60 mg/kg 口服，每日一次，共 7 天；或 40 mg/kg 每日一次）；ID8 模型（30 mg/kg 口服，每日一次）。 阅读提示：Methods: Synthetic lethal RNAi screens; Results: Figure 1 and 7 legends |
| ODF2L 敲低 | ODF2L shRNA 靶序列（#1: CCAGTGAAAGTCATCTCAGCT; #2: GCGGAGTTGGTAACTCATTCT）及 shRNA 抗性 ODF2L 突变序列。 阅读提示：Methods: Stable knockdown cell generation; Supplemental Table 1 |
| DNA 损伤检测 | γH2AX 免疫荧光和流式检测条件：AZD1775 处理 48 小时（免疫荧光）或 24 小时（Western blot）；碱性彗星实验处理 48 小时。 阅读提示：Methods: Immunofluorescence, Alkaline comet assay, γH2AX detection by immunofluorescence and flow cytometry |
| CDK1 活性检测 | G1/S 同步释放后 AZD1775 处理 4 小时，使用 GST-PP1Cα 底物和 400 μmol/L ATP 进行激酶反应。 阅读提示：Methods: Cell synchronization and G1/S release; CDK1 kinase activity assay |
| 体内模型建立 | 肿瘤接种细胞数：A2780 0.5×10^6 或 1×10^6 细胞皮下注射；ID8-Luc 腹腔注射。治疗起始时间：接种后 3 天（A2780）或 7 天（ID8）。肿瘤体积计算：4π/3 × (width/2)^2 × (length/2)。 阅读提示：Methods: In vivo studies |
| 联合治疗 | siODF2L-LNP 剂量 0.75 mg/kg，每周两次；AZD1775 30 mg/kg 口服每日一次。使用 ASSET 平台和 anti-EGFR 抗体包被。 阅读提示：Methods: Preparation of LNPs and targeted ASSET LNP assembly; Figure 7 legend |