验证LckS59A T细胞的TCR近端信号
验证LckS59A突变是否影响TCR近端信号传导及CsA对信号的抑制效果
纯化的WT和LckS59A T细胞经抗CD3交联刺激，免疫印迹检测LckY394、ZAP70Y493、LATY171、PLCγ1Y783等磷酸化水平，并比较CsA处理的影响。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
钙调磷酸酶抑制剂通过非NFAT依赖的T细胞受体信号抑制减轻急性移植物抗宿主病
Calcineurin inhibitors suppress acute graft-versus-host disease via NFAT-independent inhibition of T cell receptor signaling
实验完整度
高包含体外TCR信号分析、NFAT活性检测、细胞增殖实验、体内aGVHD模型、组织病理、流式细胞术、2光子成像和黏附实验等多个独立证据层级，并明确进行了功能验证和机制验证。
主要模型
LckS59A敲入小鼠 P14 TCR转基因小鼠 BAF1小鼠aGVHD模型 DCEK细胞系
重点核对
LckS59A敲入小鼠第59位丝氨酸突变为丙氨酸，无法被磷酸化 CsA浓度：体外100 ng/mL，体内20 mg/kg/天 aGVHD诱导：BAF1受体照射后移植B6 TCD-BM和LN细胞 T/DC黏附实验：AND或P14 T细胞与抗原脉冲的DCEK细胞共培养30分钟 2光子成像：DC和T细胞标记后足垫注射和静脉注射，CsA处理时间点
摘要
钙调磷酸酶磷酸酶活性抑制剂（CNIs）如环孢素A（CsA）广泛用于治疗组织移植排斥和急性移植物抗宿主病（aGVHD），其机制范式是抑制依赖活化T细胞核因子（NFAT）的基因表达。我们最近报道CNIs通过阻止钙调磷酸酶介导的LckS59（一种抑制性修饰）的去磷酸化来抑制TCR近端信号，提示CNIs抑制免疫反应可能存在另一种机制。在此，我们使用表达LckS59A（第59位残基不能接受磷酸基团）的小鼠T细胞诱导aGVHD。尽管CsA抑制表达LckWT或LckS59A的异基因攻击性T细胞中NFAT依赖性基因上调，但当T细胞表达LckS59A时，CsA治疗疾病无效。发现LckS59A T细胞中有两种重要的非NFAT依赖性T细胞功能对CsA具有抗性：组织浸润CD8+ T细胞中溶细胞蛋白穿孔素的上调，以及淋巴结中抗原特异性T/DC黏附和聚集。这些结果表明，CsA有效治疗aGVHD需要抑制非NFAT依赖的TCR信号。鉴于NFAT广泛表达且脱靶效应是CNI使用的主要限制，直接靶向TCR相关钙调磷酸酶可能提供毒性较低的有效疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CsA在治疗aGVHD时，其免疫抑制效果是通过抑制NFAT依赖性基因表达，还是通过抑制TCR近端信号（LckS59去磷酸化），或两者兼有？
- 核心机制
- CsA通过抑制钙调磷酸酶对LckS59的去磷酸化，从而抑制TCR近端信号，进而抑制LFA-1介导的T/DC黏附、CD8+ T细胞穿孔素表达和T细胞增殖，这是其治疗aGVHD的主要机制，而非NFAT依赖性基因表达抑制。
- 主要证据
- 在LckS59A T细胞中，CsA虽同等抑制NFAT依赖性基因（IL-2、IFN-γ）表达，但无法抑制TCR近端信号、T/DC黏附、穿孔素表达及aGVHD，而LckWT T细胞中这些效应均被CsA抑制。
- 研究意义
- 针对TCR相关钙调磷酸酶直接靶向治疗可能在抑制免疫反应同时减少CNIs的脱靶毒性（如肾损伤），为自身免疫病和移植排斥治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测NFAT活性及NFAT依赖性基因表达
确认LckS59A突变不影响NFAT核转位及其下游基因表达，且CsA对两者抑制程度在WT和突变体间无差异
通过成像流式细胞术检测NFAT1核转位，流式细胞术检测CD69、CD25表达，ELISA检测IL-2、IFN-γ分泌，均在WT和LckS59A T细胞中比较CsA处理效果，并用P14转基因T细胞进行验证。
评估CsA对T细胞增殖的敏感性
比较WT和LckS59A T细胞对抗原诱导增殖的CsA敏感性差异
P14 TCR转基因CD8+ T细胞用CellTrace Violet标记，与gp33肽脉冲的BMDCs共培养，流式细胞术分析分裂情况，计算分裂百分比和扩增指数。
建立aGVHD模型并评估CsA疗效
确定CsA对WT和LckS59A供体T细胞诱导的aGVHD的治疗效果差异
致死照射的BAF1受体小鼠移植T细胞去除的骨髓和LN细胞（WT或LckS59A供体），给予CsA或对照，每日评分临床aGVHD，监测死亡率，30天后肝脏组织病理学评分，并分析肝脏浸润细胞。
检测aGVHD中CD8+ T细胞的效应功能
评估CsA对WT和LckS59A CD8+ T细胞穿孔素、颗粒酶B和脱粒标志物CD107a表达的影响
从aGVHD小鼠肝脏分离浸润细胞，流式细胞术检测CD8+ T细胞中穿孔素、颗粒酶B和表面CD107a表达，并比较CsA处理的效果。
体外T细胞黏附实验
验证CsA对抗原诱导的T/APC黏附的抑制是否依赖LckS59去磷酸化
将AND或P14 T细胞与表达I-Ek/H-2Db和ICAM1的DCEK细胞（脉冲相关肽）共培养，加或不加CsA，测定黏附细胞数。
体内T/DC相互作用成像
在体内观察CsA对抗原特异性T/DC簇形成的抑制是否依赖LckS59去磷酸化
将标记的DC注入足垫，标记的T细胞静脉注射，使用双光子显微镜成像引流淋巴结，分析T/DC簇的百分比和大小，并评估CsA处理（长期或短期）的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 磷酸化ZAP-70 (Tyr319)抗体 | Cell Signaling Technologies | 2701 |
| 磷酸化PLCγ1 (Tyr783)抗体 | Cell Signaling Technologies | 2821 | |
| 磷酸化LAT (Tyr171)抗体 | Cell Signaling Technologies | 3581 | |
| 磷酸化ZAP-70 (Tyr493)抗体 | Cell Signaling Technologies | 2704 | |
| ZAP-70抗体 | Cell Signaling Technologies | 2705 | |
| 磷酸化SRC (Tyr416)抗体 | Cell Signaling Technologies | 2101 | |
| 磷酸化p38 (Thr180/Tyr182)抗体 | Cell Signaling Technologies | 9211 | |
| p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| 磷酸化CD18 (Thr758)抗体 | Abcam | 63388 | |
| 流式细胞术 | FITC抗CD8α抗体 | eBioscience | 11-0081-85 |
| PE抗IFN-γ抗体 | eBioscience | 12-7311-41 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | eBioscience | 12-8898-82 | |
| PE-Cy7抗CD69抗体 | eBioscience | 25-0691-82 | |
| APC抗H-2Kb抗体 | eBioscience | 17-5958-80 | |
| APC抗IL-2抗体 | eBioscience | 17-7021-81 | |
| 抗穿孔素抗体 | eBioscience | 17-9392-80 | |
| 抗Foxp3抗体 | eBioscience | 17-5773-82 | |
| eFluor450抗CD4抗体 | eBioscience | 48-0041-82 | |
| FITC抗CD107a抗体 | BD Biosciences | 553793 | |
| 抗CD4抗体 | BD Biosciences | 553047 | |
| PE抗CD25抗体 | BD Biosciences | 553866 | |
| PE-Cy7抗CD4抗体 | BD Biosciences | 552775 | |
| APC抗CD8α抗体 | BD Biosciences | 553035 | |
| AF700抗TCR-β抗体 | BD Biosciences | 560705 | |
| PerCP-Cy5.5抗CD4抗体 | BD Biosciences | 550954 | |
| BV510抗CD8α抗体 | BD Biosciences | 563068 | |
| 抗FcγRII/III受体抗体 | BD Biosciences | -- | |
| PE-Cy7抗H-2Db抗体 | BioLegend | 111516 | |
| PE抗NFAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14335 | |
| T细胞激活 | 功能级纯化抗人CD3抗体 | eBioscience | 16-0037-85 |
| 抗小鼠CD3ε抗体 | BioLegend | 100302 | |
| 抗小鼠CD28抗体 | BioLegend | 102102 | |
| 山羊抗 Armenian 仓鼠 IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 127-005-160 | |
| 驴抗小鼠 IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-005-150 | |
| 细胞内染色 | BD Cytofix/Cytoperm固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| 含莫能菌素的蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 554724 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 抗原肽 | 蛾细胞色素c肽88-103 | Peptide 2.0 | -- |
| gp33肽33-41 | Peptide 2.0 | -- | |
| OVA肽257-264 | Peptide 2.0 | -- | |
| 黏附实验 | 重组人ICAM1-CD54-Fc嵌合体 | R&D Systems | 720-IC-050 |
| 药物处理 | 环孢素A | MilliporeSigma | C3662 |
| 体内注射 | 环孢素A（Sandimmune注射液） | Novartis | -- |
| 细胞培养 | 小鼠GM-CSF | Peprotech | 315-03 |
| T细胞分离 | EasySep小鼠T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19851 |
| 增强型人T细胞免疫柱 | Cedarlane | CL100 | |
| 细胞分离 | Lympholyte-M淋巴细胞分离液 | Cedarlane | -- |
| ELISA | 小鼠IL-2 ELISA试剂盒 | eBioscience | -- |
| IFN-γ小鼠未包被ELISA试剂盒 | eBioscience | 88-7314-86 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 成像标记 | CellTracker Green CMFDA染料 | Invitrogen | C7025 |
| CellTracker Deep Red染料 | Invitrogen | C34565 | |
| 增殖实验 | CellTrace Violet细胞增殖试剂盒 | Invitrogen | C34557 |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒（紫外激发） | Invitrogen | L23105 |
| 免疫印迹 | SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | 34096 |
| SuperSignal West Dura扩展持续时间底物 | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| 细胞培养 | 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 |
| Hank's平衡盐溶液 | Gibco | 14175103 | |
| 组织透明 | FocusClear溶液 | CelExplorer Lab | FC-101 |
| MountClear溶液 | CelExplorer Lab | MC-301 | |
| 流式细胞术 | LSRII流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 成像流式细胞术 | ImageStreamX Mark II成像流式细胞仪 | Amnis | -- |
| 双光子显微镜 | MPE-RS双光子显微镜 | Olympus | -- |
| Insight DS+激光器 | Spectra Physics | -- | |
| XLPLN25XWMP2水浸物镜 | Olympus | -- | |
| 免疫印迹 | Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- |
| 数据分析 | FlowJo软件 | -- | -- |
| 成像分析 | Imaris软件 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7软件 | -- | -- |
| 细胞分选 | EasySep链霉亲和素磁珠 | STEMCELL Technologies | -- |
| 细胞培养 | Zeocin抗生素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TCR近端信号检测 | LckS59A小鼠基因型；T细胞刺激时间点；CsA浓度（100 ng/mL）；抗体克隆和稀释度 阅读提示：Methods: Immunoblot analysis, Figure 1 legend |
| NFAT活性检测 | 刺激时间（30分钟）；CsA浓度；NFAT1核转位评分标准 阅读提示：Methods: Flow cytometry, Figure 2 legend |
| T细胞增殖实验 | CellTrace Violet浓度（5 μM）；BMDC制备和成熟条件；gp33浓度（10 nM）；共培养时间（48小时）；CsA浓度梯度 阅读提示：Methods: Quantitating cell division, Figure 3 legend |
| aGVHD模型 | 受体照射剂量（8-10 Gy）；供体细胞数量（1×10^7 TCD-BM + 5×10^6 LN）；CsA剂量（20 mg/kg/天 i.p.）；临床评分标准 阅读提示：Methods: Induction of acute GVHD, Figure 4 legend |
| T/DC黏附实验 | DCEK细胞系和肽脉冲浓度（1 μM）；共培养时间（30分钟）；CsA浓度（100 ng/mL）；洗涤次数 阅读提示：Methods: T cell adhesion assay, Figure 6 legend |
| 双光子成像 | DC和T细胞标记物及浓度；注射途径和时间；CsA处理方案；成像参数 阅读提示：Methods: Imaging by 2-photon microscopy, Figure 7 legend |