鉴定PT及其细胞毒性
从植物提取物中筛选并鉴定具有抗肿瘤增殖活性的化合物。
构建包含422种植物提取物的文库，用K562细胞筛选细胞毒性，通过HPLC分馏和细胞毒性筛选鉴定活性成分，最终确定PT为最丰富和有效的活性成分。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
蜂斗菜素有效抑制支持肿瘤生长和转移的线粒体复合物I代谢
Petasin potently inhibits mitochondrial complex I-based metabolism that supports tumor growth and metastasis
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、功能验证（NDI1、Rho-0细胞）、代谢组学、蛋白质组学、多种体内模型（同系和异种移植）及转移模型。
主要模型
B16F10小鼠黑色素瘤细胞 A2058人黑色素瘤细胞 NB-1人神经母细胞瘤细胞 Jyg-MCB小鼠转移性乳腺癌细胞
重点核对
PT处理浓度：3 μM（体外） PT给药剂量：50 mg/kg，腹腔注射（体内） B16F10黑色素瘤原位模型（同系） A2058和NB-1异种移植模型 Jyg-MCB自发转移模型
摘要
线粒体电子传递链复合物I（ETCC1）是癌症代谢的核心，但能够安全抑制体内肿瘤生长和转移的强效ETCC1抑制剂有限。通过植物提取物筛选，我们鉴定出蜂斗菜素（PT）是一种高活性的ETCC1抑制剂，其化学结构不同于常规抑制剂。PT的活性比二甲双胍或苯乙双胍高至少1700倍，并对广泛的肿瘤类型诱导细胞毒性。PT给药在多种同系和异种移植小鼠模型中也诱导了显著的生长抑制。尽管其效力更高，但对非肿瘤细胞和正常器官无明显毒性。此外，PT处理在体外减弱了细胞运动和粘着斑，并在体内减弱了肺转移。代谢组和蛋白质组分析显示，PT严重耗竭天冬氨酸水平，破坏肿瘤相关的核苷酸合成和糖基化代谢，并下调与增殖和转移相关的主要癌蛋白。这些发现表明PT作为强效ETCC1抑制剂靶向肿瘤细胞代谢脆弱性的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PT能否通过抑制ETCC1来抑制肿瘤生长和转移，其机制是什么？
- 核心机制
- PT通过抑制ETCC1导致NAD/NADH比降低，进而引起天冬氨酸耗竭、核苷酸合成和糖基化受损，最终下调与增殖和转移相关的癌蛋白（如c-Myc、EGFR、Akt）并诱导坏死性细胞死亡。
- 主要证据
- PT在多种肿瘤细胞系中诱导细胞毒性，降低NAD/NADH比，耗尽天冬氨酸，下调癌蛋白，并在B16F10原位模型、A2058和NB-1异种移植模型及Jyg-MCB自发转移模型中抑制肿瘤生长和转移。
- 研究意义
- PT作为强效ETCC1抑制剂，通过同时破坏支持肿瘤生长和转移的多种代谢途径，为治疗具有异质性分子背景的转移性肿瘤提供了一种新策略，并可作为开发新型低毒ETCC1抑制剂的先导化合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞毒性测定
评估PT对多种肿瘤和非肿瘤细胞系的细胞毒性作用。
用PT处理多种细胞系，测定细胞活力、细胞周期、形态变化、代谢改变（葡萄糖、乳酸、pH）、ATP/ADP比和细胞死亡方式。
线粒体复合物I抑制活性验证
验证PT对ETCC1的抑制活性，并比较其与二甲双胍和苯乙双胍的效力。
检测PT对线粒体各复合物活性的影响，测定ETCC1抑制的IC50，并通过NDI1过表达和Rho-0细胞验证ETCC1抑制是PT细胞毒性的机制。
代谢组学分析
揭示PT对肿瘤和正常细胞代谢的影响。
用PT处理B16F10和ASF 4-1细胞，进行代谢组学分析，鉴定显著改变的代谢物和通路。
转录组学分析
评估PT对肿瘤细胞转录组的影响，特别是ATF4信号通路。
用PT处理A2058细胞，进行cDNA微阵列分析，鉴定差异表达基因，并进行通路富集分析。
蛋白质组学和免疫印迹
分析PT对癌蛋白表达和糖基化的影响。
用PT处理多种细胞系，进行蛋白质组学分析和免疫印迹，检测癌蛋白、糖基化蛋白和信号通路（如AMPK/mTOR）。
体内抗肿瘤活性评估
评估PT在多种小鼠模型中的抗肿瘤效果和安全性。
在B16F10原位同系模型、A2058和NB-1异种移植模型、Jyg-MCB自发转移模型中给予PT（50 mg/kg，i.p.），监测肿瘤生长、转移灶、体重和正常器官毒性。
体外迁移和侵袭抑制实验
评估PT对肿瘤细胞迁移、侵袭和粘附的影响。
进行划痕愈合实验、Matrigel侵袭实验、细胞粘附实验和粘着斑分析，检测PT处理对细胞运动性和侵袭能力的影响。
体内转移抑制实验
评估PT对肺转移和淋巴结转移的抑制作用。
使用B16F10肺定植模型和Jyg-MCB自发转移模型，PT给药后计数肺转移灶和淋巴结重量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞活力测定
细胞周期分析
线粒体功能分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Wako | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| EMEM培养基 | Wako | -- | |
| RPMI1640培养基 | Wako | -- | |
| 乳腺上皮细胞基础培养基 | Lonza | CC-3151 | |
| 乳腺上皮细胞生长培养基试剂盒 | Lonza | CC-3150 | |
| MEM非必需氨基酸溶液（100×） | Wako | 139-15651 | |
| MEM必需氨基酸溶液（50×） | Wako | 132-15641 | |
| L-天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8644 | |
| 蛋白质印迹 | DC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| PVDF膜 | EMD Millipore | Immobilon-P | |
| PVDF封闭试剂 | TOYOBO | -- | |
| HRP标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | -- | |
| HRP标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | -- | |
| Luminata Forte Western HRP底物 | EMD Millipore | -- | |
| 抗β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 | |
| RT-qPCR | NucleoSpin miRNA提取试剂盒 | MACHEREY-NAGEL | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| Universal SYBR Select预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| Takara Thermal Cycler Dice实时荧光定量PCR系统II | Takara | -- | |
| 组织学 | Tissue-Tek伊红 | Sakura Finetek Japan | 8659 |
| 免疫活性抗原修复缓冲液 | Matsunami Glass | IA6500, IA9500 | |
| ImmPRESS HRP马抗兔IgG聚合物检测试剂盒 | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| ImmPACT DAB底物 | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 显微镜BZ-X700 | KEYENCE | -- | |
| 免疫细胞化学 | 抗p-FAKY397抗体 | Cell Signaling Technology | 8556 |
| Alexa Fluor 488标记抗兔抗体 | Life Technologies | -- | |
| Alexa Fluor 568标记鬼笔环肽 | Life Technologies | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Lab Vision PermaFluor封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 显微镜 | 共聚焦显微镜LSM-710 | Carl Zeiss | -- |
| 软件分析 | ImageJ | NIH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系和培养基的选择（DMEM, EMEM, RPMI1640等），血清浓度，细胞来源 阅读提示：Methods: Cell lines and culture |
| 体外细胞毒性 | PT浓度、处理时间、细胞活力测定方法 阅读提示：Figure 1 and Figure 2 legends |
| 线粒体复合物I活性测定 | PT浓度、线粒体来源、ETCC1活性测定方法 阅读提示：Figure 3 legend and Methods: Mitochondrial ETC activity assays |
| 代谢组学分析 | 细胞系、PT浓度、处理时间、代谢物提取方法、分析平台 阅读提示：Figure 4 legend and Supplemental Methods |
| 体内肿瘤模型 | PT剂量、给药途径、给药频率、模型类型（B16F10, A2058, NB-1, Jyg-MCB） 阅读提示：Figure 8 legend and Methods: Animal experiments |
| 转移模型 | 细胞系、PT剂量、给药途径、给药频率、转移评估方法 阅读提示：Figure 10 legend and Methods: Animal experiments |
| 细胞迁移和侵袭 | PT浓度、处理时间、实验方法（划痕愈合、侵袭、粘附） 阅读提示：Figure 9 legend and Methods: Scratch wound healing assay, Matrigel invasion assay, Cell attachment assay |