建立可诱导Ngly1敲除小鼠模型
模拟NGLY1缺陷的神经退行性疾病并评估其表型
通过他莫昔芬诱导Ngly1fl/flUBC-cre/ERT2小鼠实现全身体敲除，评估体重、寿命、运动功能和神经病理。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
STING通路驱动NGLY1缺陷中的非炎症性神经退行性变
The STING pathway drives noninflammatory neurodegeneration in NGLY1 deficiency
实验完整度
高包含可诱导全身敲除小鼠模型、细胞类型特异性敲除、遗传挽救（Sting1敲除）、药理学抑制、snRNA-seq、患者样本等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
可诱导全身Ngly1敲除小鼠（iNgly1−/−） C57BL/6-JF1品系Ngly1−/−小鼠 NGLY1缺陷患者小脑组织 SK-N-SH神经母细胞瘤细胞系
重点核对
iNgly1−/−小鼠通过他莫昔芬诱导Ngly1敲除，出生后第7天开始连续5天给药，断奶后再次给药5天 Sting1敲除（iNgly1−/−Sting1−/−）挽救浦肯野细胞丢失、运动功能和寿命 STING抑制剂VS-X4口服给药，剂量10 mg/kg，每周三次，持续3个月 snRNA-seq分析使用8周龄小鼠，每种基因型2只 行为学评分采用4项指标（后肢紧握、边缘行走、步态、脊柱后凸）的12分制
摘要
STING通路日益被认为是神经退行性疾病中神经炎症的关键调节因子，但其在非炎症条件下的作用仍不清楚。我们生成了一种出生后诱导的全身体Ngly1敲除小鼠（iNgly1−/−）来模拟NGLY1缺陷，这是一种早发性神经退行性疾病。iNgly1−/−小鼠表现出进行性运动缺陷、浦肯野细胞丢失和寿命缩短，而没有胶质增生或免疫激活的证据。在浦肯野细胞或小胶质细胞中特异性删除Ngly1未能诱导疾病，提示需要多种细胞内在和细胞外在信号。在iNgly1−/−小鼠中基因消除Sting1可挽救浦肯野细胞丢失、改善运动功能并延长寿命。单核RNA测序揭示浦肯野细胞中蛋白质稳态破坏、小脑颗粒细胞亚群改变以及STING依赖的胶质细胞胆固醇生物合成抑制。使用口服生物活性拮抗剂VS-X4对STING进行药理学抑制可显著减轻神经病理和运动疾病。这些发现确定STING是NGLY1缺陷神经病理的关键介质，并提示STING在非炎症性神经系统疾病中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- STING通路在NGLY1缺陷导致的非炎症性神经退行性变中是否起关键作用？
- 核心机制
- NGLY1缺失导致线粒体DNA泄漏，激活cGAS-STING通路，STING信号抑制胶质细胞胆固醇生物合成，并介导浦肯野细胞凋亡，而这一过程不伴随经典的神经炎症。
- 主要证据
- iNgly1−/−小鼠表现出浦肯野细胞丢失和运动缺陷；Sting1敲除或STING抑制剂VS-X4显著改善这些表型；snRNA-seq显示STING依赖的胆固醇生物合成抑制。
- 研究意义
- 研究提示STING是NGLY1缺陷神经病理的关键介质，并可能成为相关非炎症性神经系统疾病的治疗靶点，口服STING拮抗剂VS-X4为治疗提供了新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估神经病理和浦肯野细胞死亡
确定NGLY1缺失导致的小脑浦肯野细胞丢失及其机制
通过IHC染色检测浦肯野细胞标记物calbindin，cleaved caspase-3标记凋亡细胞，COX IV标记线粒体。
遗传学挽救实验（Sting1敲除）
验证STING通路在疾病中的因果作用
将Ngly1fl/flUBC-cre/ERT2与Sting1−/−杂交，诱导敲除后评估寿命、运动功能、浦肯野细胞数量和凋亡。
snRNA-seq转录组分析
揭示细胞类型特异性分子变化和STING依赖的效应
对8周龄Ngly1fl/fl、iNgly1−/−和iNgly1−/−Sting1−/−小鼠小脑进行单核RNA测序，分析差异表达基因和细胞亚群。
药理学抑制STING评估治疗效果
验证STING拮抗剂能否缓解疾病表型
使用口服STING抑制剂VS-X4治疗iNgly1−/−小鼠，评估运动功能、发病时间和浦肯野细胞数量。
STING激活机制探索
确定STING激活的上游机制
通过cGAS免疫沉淀和qPCR检测cGAS结合的mtDNA，并用药物降低胆固醇水平评估对STING通路的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型诱导 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 辛伐他汀 | MedChemExpress | HY-17502 |
| 甲基-β-环糊精 | MedChemExpress | HY-101461 | |
| STING激活 | diABZI | -- | -- |
| 免疫组织化学 | 抗钙结合蛋白D-28K抗体 | Sigma-Aldrich | C9848 |
| 抗Iba1/AIF1抗体 | MilliporeSigma | MABN92 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) 抗体 | Cell Signaling | 9661 | |
| 抗COX IV抗体 | Abcam | ab16056 | |
| PSMB2抗体 | Abcam | ab236752 | |
| TAX1BP1多克隆抗体 | Proteintech | 14424-1-AP | |
| HMGCR抗体 | LifeSpan BioSciences | LS-B16059 | |
| 山羊抗兔IgG二抗，Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32731 | |
| 驴抗小鼠IgG二抗，Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
| 驴抗小鼠IgG二抗，Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 抗NGLY1抗体 | Atlas Antibodies | HPA036825 | |
| Western blot | BCA蛋白定量 | -- | -- |
| SDS-PAGE凝胶电泳 | -- | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| HRP标记二抗 | Bio-Rad | -- | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗HMGB1抗体 | Abcam | ab18256 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling | 2118 | |
| 免疫沉淀 | cGAS抗体 | Abcam | ab252416 |
| Protein G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| DNA提取 | QIAamp DNA小提试剂盒 | Qiagen | 56304 |
| RNA提取 | TRI试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| qPCR | iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- |
| snRNA-seq | Chromium单细胞5'试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| Nuclei EZ裂解缓冲液 | MilliporeSigma | EZ PREP NUC-101 | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | AM2618 | |
| RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| Flowmi细胞过滤器 | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 动物实验 | VS-X4 | Spring Bank Pharmaceuticals | -- |
| 胆固醇检测 | 胆固醇/胆固醇酯-Glo检测试剂盒 | Promega | J3190 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型诱导 | 他莫昔芬诱导方案（剂量、时间点）、对照组、小鼠品系 阅读提示：Materials and methods - Animals |
| 行为学评估 | 评分系统、评估时间点 阅读提示：Materials and methods - Mouse motor function tests |
| 组织病理和IHC | 抗体、稀释度、固定方法 阅读提示：Materials and methods - Histopathology and immunohistochemistry |
| snRNA-seq | 小鼠周龄、样本量、测序平台、分析软件和参数 阅读提示：Materials and methods - snRNA-seq and data analysis |
| 药理学抑制STING | VS-X4剂量、给药方式、治疗周期、对照组 阅读提示：Materials and methods - Mouse treatment |
| STING激活机制 | cGAS IP条件、qPCR引物、胆固醇药物浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods - Immunoprecipitation of endogenous cGAS and DNA analysis; Figure S5 legend |