内皮C3a受体介导衰老过程中的血管炎症和血脑屏障通透性

Endothelial C3a receptor mediates vascular inflammation and blood-brain barrier permeability during aging

作者信息Nicholas E Propson, Ethan R Roy, Alexandra Litvinchuk, Jörg Köhl, Hui Zheng

PMID32990682

期刊J Clin Invest

发布时间2021-01-04

DOI10.1172/JCI140966

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实验完整度

高

包含基因敲除小鼠（C3ar1-/-、内皮特异性T2KO）、药理学抑制（C3aRA）、体外BBB模型（TEER）、免疫染色、流式细胞术及RNA-Seq分析等多层级验证

主要模型

C57BL/6J小鼠 C3ar1-/-小鼠 C3ar1fl/fl Tie2-Cre (T2KO)小鼠 PS19 tau转基因小鼠原代人脑微血管内皮细胞（HBMECs）与星形胶质细胞共培养

重点核对

C3aR在脑内皮细胞中的表达及C3a/C3aR信号对VCAM1的调控衰老过程中外周CD8+ T细胞向脑实质的浸润及C3aR的依赖性 C3aR抑制对老年小鼠血管形态（横截面积、迂曲度）和BBB通透性（TRITC-dextran渗漏）的改善体外BBB模型中C3a通过细胞内Ca2+信号导致VE-cadherin下调的机制内皮特异性C3ar1敲除（T2KO）对血管表型、小胶质细胞反应性和神经变性的挽救

摘要

免疫和血管系统的功能障碍与衰老和阿尔茨海默病有关；然而，它们之间的相互关系仍知之甚少。补体途径是大脑中先天免疫的公认调节因子。在此，我们报告了衰老过程中血管炎症、外周淋巴细胞浸润和血脑屏障（BBB）通透性的稳健年龄依赖性增加。这些表型通过C3ar1的全局失活和内皮细胞特异性消除而减弱。使用体外BBB模型，我们确定了细胞内Ca2+是C3a/C3aR信号的下游效应器，并且是血管内皮钙粘蛋白连接和屏障完整性的功能性介质。内皮C3ar1失活也减弱了小胶质细胞反应性，并改善了衰老大脑中的海马和皮质体积，证明了脑血管功能障碍与免疫细胞活化和神经变性之间的串扰。此外，在tau转基因小鼠模型中也观察到显著的C3aR依赖性血管炎症。我们的研究表明，通过内皮细胞的增强C3a/C3aR信号促进血管炎症和BBB功能障碍，并有助于衰老和神经退行性疾病中的整体神经炎症。关键词：衰老；阿尔茨海默病

验证衰老过程中C3和C3aR的表达

确认C3在衰老脑中的表达变化及其与星形胶质细胞和内皮细胞的关系

通过ELISA检测不同月龄（2、12、20月龄）小鼠脑裂解液中C3蛋白水平；通过免疫荧光共染色观察C3与GFAP+星形胶质细胞的共定位；分离脑微血管并用免疫染色检测C3aR在VE-cadherin+内皮细胞上的表达。

评估C3a/C3aR信号对血管炎症和免疫细胞浸润的影响

探究C3aR信号是否调控衰老相关的血管VCAM1表达和外周淋巴细胞浸润

通过免疫荧光检测不同月龄WT和C3ar1-/-小鼠皮质血管中VCAM1表达；用C3aR拮抗剂SB290157处理小鼠，观察VCAM1表达变化；通过流式细胞术分析脑内CD45hi/CD11b-淋巴细胞比例；在LPS诱导的急性神经炎症模型中，检测C3ar1缺失对淋巴细胞浸润和Vcam1表达的影响。

分析浸润淋巴细胞亚型及来源

确定浸润至衰老脑内的淋巴细胞亚型和外周来源

通过流式细胞术分析20月龄WT小鼠脑和脾脏中淋巴细胞亚型（CD3、CD19、CD8、CD4）；使用mT/mG报告基因小鼠（MXG）追踪外周细胞；通过免疫荧光观察CD8+ T细胞在脑内的分布和浸润阶段。

评估C3aR抑制对血管形态和BBB通透性的影响

探究C3aR信号对衰老相关血管形态变化和BBB完整性的作用

使用共聚焦成像和IMARIS三维重建分析不同月龄小鼠海马毛细血管横截面积和迂曲度；通过尾静脉注射TRITC-dextran检测BBB渗漏；分离脑微血管并检测VE-cadherin表达。

体外BBB模型研究C3a介导屏障破坏的机制

在体外模拟BBB，研究C3a/C3aR信号如何影响屏障功能及其分子机制

建立人星形胶质细胞和人脑微血管内皮细胞（HBMECs）共培养模型，测量跨内皮电阻（TEER）；用C3a处理，检测TEER变化；使用钙螯合剂（BAPTA-AM）、钙调蛋白抑制剂（W7）等，观察对TEER和VE-cadherin、pMLC的影响。

内皮特异性C3ar1敲除对衰老表型的影响

确定C3aR在内皮细胞中的细胞自主作用及其对神经炎症和神经变性的影响

生成内皮特异性C3ar1敲除小鼠（T2KO，C3ar1fl/fl Tie2-Cre），在3月龄和12-14月龄时分析血管VCAM1表达、血管形态、小胶质细胞反应性（CD68/IBA1）和海马、内嗅皮层体积。

在PS19 tau转基因小鼠中验证C3aR依赖性血管表型

评估C3aR信号在tau蛋白病模型中对血管炎症和形态的影响

分析9月龄PS19和PS19 C3ar1-/-小鼠海马和皮质组织中VCAM1表达和血管形态；利用已发表的RNA-Seq数据进行通路富集分析。

实验环节	名称	品牌	货号
蛋白检测	C3 ELISA试剂盒	--	--
免疫染色	抗GFAP抗体	MilliporeSigma	G9269
抗C3aR抗体	Hycult	10130173
抗VE-钙粘蛋白抗体	R&D Systems	AF1002
抗CD31抗体	BD Biosciences	550274
抗VCAM1抗体	BioLegend	305802
抗CD68抗体	--	--
抗IBA1抗体	--	--
抗Glut1抗体	Thermo Fisher Scientific	MA1-37783
抗PDGFR-β抗体	R&D Systems	AF1042
抗IV型胶原抗体	Abcam	ab6586
流式细胞术	抗CD45-BV421抗体	BD Biosciences	563890
抗CD11b-FITC抗体	BD Biosciences	553310
抗CD3ε-BV650抗体	BD Biosciences	564378
抗CD19-BV480抗体	BD Biosciences	566167
抗CD4-PE抗体	BD Biosciences	553730
抗CD8a-APC抗体	BD Biosciences	553035
抗CD45-BUV395抗体	BD Biosciences	564279
抗CD49a-VioBright PE抗体	Miltenyi Biotec	130-107-632
抗ACSA-2-APC抗体	Miltenyi Biotec	130-116-245
LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染料	Thermo Fisher Scientific	L23105
细胞培养	EGM2-MV培养基	Lonza	CC-3202
星形胶质细胞培养基	ScienCell	1801
纤连蛋白	--	--
IV型胶原	--	--
多聚-D-赖氨酸	--	--
细胞处理	重组人C3a	R&D Systems	3677-C3-025
C3aR拮抗剂SB290157	Calbiochem	559410
BAPTA-AM	Tocris	2787
W7	Tocris	0369
离子霉素	Cayman Chemical	10004974
白细胞介素-1β	R&D Systems	201-LB-005
C5a	R&D Systems	2037-C5-025
细胞培养	胰蛋白酶EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
组织分离	木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical	LK003172
脱氧核糖核酸酶	Worthington Biochemical	LK003178
Percoll PLUS	MilliporeSigma	E0414-250ML
胶原酶/分散酶	MilliporeSigma	10269638001
BD Fc Block	小鼠BD Fc受体阻断剂	BD Biosciences	553141
RNA提取	RNeasy Micro试剂盒	QIAGEN	74004
逆转录	iScript逆转录预混液	Bio-Rad	1708840
qRT-PCR	iTaq通用SYBR Green预混液	Bio-Rad	172-5120
CFX384 Touch实时荧光定量PCR检测系统	Bio-Rad	--
TEER	STX2筷子电极	World Precision Instruments	--
EVOM2电压/欧姆计	World Precision Instruments	--
细胞培养	Transwell插入小室（24孔）	Corning	3470
BBB渗漏检测	TRITC-葡聚糖（分子量65-85kDa）	Sigma-Aldrich	T1162
免疫荧光	凝集素-649	Vector Labs	DL-1178
鬼笔环肽CruzFluor 555	Santa Cruz Biotechnology	sc-363794
抗pMLC2 Ser19抗体	Cell Signaling Technology	3671
抗人VE-钙粘蛋白抗体	R&D Systems	AF938
抗C3抗体	Hycult	10129042
抗CD106（VCAM1）抗体	BioLegend	305802
成像	徕卡TCS激光共聚焦显微镜	Leica	--
EVOS FL Auto成像系统	Thermo Fisher Scientific	--
Nanozoomer 2.0-HT数字切片扫描系统	Hamamatsu	--
成像分析	IMARIS 9.2.1软件	Bitplane	--
ImageJ软件	NIH	--
统计	GraphPad Prism软件	GraphPad Software	--

实验环节

名称

品牌

货号

蛋白检测

C3 ELISA试剂盒

免疫染色

抗GFAP抗体

MilliporeSigma

G9269

抗C3aR抗体

Hycult

10130173

抗VE-钙粘蛋白抗体

R&D Systems

AF1002

抗CD31抗体

BD Biosciences

550274

抗VCAM1抗体

BioLegend

305802

抗CD68抗体

抗IBA1抗体

抗Glut1抗体

Thermo Fisher Scientific

MA1-37783

抗PDGFR-β抗体

R&D Systems

AF1042

抗IV型胶原抗体

Abcam

ab6586

流式细胞术

抗CD45-BV421抗体

BD Biosciences

563890

抗CD11b-FITC抗体

BD Biosciences

553310

抗CD3ε-BV650抗体

BD Biosciences

564378

抗CD19-BV480抗体

BD Biosciences

566167

抗CD4-PE抗体

BD Biosciences

553730

抗CD8a-APC抗体

BD Biosciences

553035

抗CD45-BUV395抗体

BD Biosciences

564279

抗CD49a-VioBright PE抗体

Miltenyi Biotec

130-107-632

抗ACSA-2-APC抗体

Miltenyi Biotec

130-116-245

LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染料

Thermo Fisher Scientific

L23105

细胞培养

EGM2-MV培养基

Lonza

CC-3202

星形胶质细胞培养基

ScienCell

1801

细胞处理

R&D Systems

3677-C3-025

C3aR拮抗剂SB290157

Calbiochem

559410

BAPTA-AM

Tocris

2787

Tocris

0369

离子霉素

Cayman Chemical

10004974

白细胞介素-1β

R&D Systems

201-LB-005

C5a

R&D Systems

2037-C5-025

细胞培养

胰蛋白酶EDTA

Thermo Fisher Scientific

25200056

组织分离

木瓜蛋白酶

Worthington Biochemical

LK003172

脱氧核糖核酸酶

Worthington Biochemical

LK003178

Percoll PLUS

MilliporeSigma

E0414-250ML

胶原酶/分散酶

MilliporeSigma

10269638001

BD Fc Block

小鼠BD Fc受体阻断剂

BD Biosciences

553141

RNA提取

RNeasy Micro试剂盒

QIAGEN

74004

逆转录

iScript逆转录预混液

Bio-Rad

1708840

qRT-PCR

iTaq通用SYBR Green预混液

Bio-Rad

172-5120

CFX384 Touch实时荧光定量PCR检测系统

Bio-Rad

TEER

STX2筷子电极

World Precision Instruments

EVOM2电压/欧姆计

World Precision Instruments

细胞培养

Transwell插入小室（24孔）

Corning

3470

BBB渗漏检测

TRITC-葡聚糖（分子量65-85kDa）

Sigma-Aldrich

T1162

免疫荧光

凝集素-649

Vector Labs

DL-1178

鬼笔环肽CruzFluor 555

Santa Cruz Biotechnology

sc-363794

抗pMLC2 Ser19抗体

Cell Signaling Technology

3671

抗人VE-钙粘蛋白抗体

R&D Systems

AF938

抗C3抗体

Hycult

10129042

抗CD106（VCAM1）抗体

BioLegend

305802

成像

徕卡TCS激光共聚焦显微镜

Leica

EVOS FL Auto成像系统

Thermo Fisher Scientific

Nanozoomer 2.0-HT数字切片扫描系统

Hamamatsu

成像分析

IMARIS 9.2.1软件

Bitplane

ImageJ软件

NIH

统计

GraphPad Prism软件

GraphPad Software

环节	核对要点
小鼠模型	小鼠品系、月龄、性别比例（约半数雌雄各半）、饲养条件（12小时光照/黑暗循环）阅读提示：Methods: Mice and treatment
C3aR抑制处理	C3aRA（SB290157）剂量（1 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、频率（隔日一次）和持续时间（4周）阅读提示：Methods: Mice and treatment
BBB通透性检测	TRITC-dextran浓度（10 mg/mL）、注射体积（100 μL）、分子量（65-85 kDa）、循环时间（2小时），荧光检测波长（激发550 nm，发射580 nm）阅读提示：Methods: Mice and treatment（BBB analysis）; 图4
体外BBB模型	细胞类型（原代人星形胶质细胞、HBMECs）、共培养顺序（先种星形胶质细胞2天，再种内皮细胞4天）、细胞密度（1.5×10^5 cells/cm^2）、TEER稳定值（约160-180 Ω），处理浓度（C3a 500 nM、IL-1β 10 ng/mL等）和时间（2小时、24小时）阅读提示：Methods: Cell culture; TEER analysis
血管形态分析	切片厚度（30 μm）、Z-stack参数（40×油镜，步长0.5 μm，总厚度30 μm）、量化方法（IMARIS Surfaces和Filaments）阅读提示：Methods: Immunostaining and image analysis
流式细胞术	组织消化方法（papain或Collagenase/Dispase）、抗体及稀释倍数（如anti-CD45-BV421 1:500）、采用CoBrA策略阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis
数据统计	统计方法（1-way ANOVA with Tukey's post hoc test或Student's t test）、显著性阈值（P<0.05）阅读提示：Statistics

环节

核对要点

小鼠模型

小鼠品系、月龄、性别比例（约半数雌雄各半）、饲养条件（12小时光照/黑暗循环）

阅读提示：Methods: Mice and treatment

C3aR抑制处理

C3aRA（SB290157）剂量（1 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、频率（隔日一次）和持续时间（4周）

阅读提示：Methods: Mice and treatment

BBB通透性检测

TRITC-dextran浓度（10 mg/mL）、注射体积（100 μL）、分子量（65-85 kDa）、循环时间（2小时），荧光检测波长（激发550 nm，发射580 nm）

阅读提示：Methods: Mice and treatment（BBB analysis）; 图4

体外BBB模型

细胞类型（原代人星形胶质细胞、HBMECs）、共培养顺序（先种星形胶质细胞2天，再种内皮细胞4天）、细胞密度（1.5×10^5 cells/cm^2）、TEER稳定值（约160-180 Ω），处理浓度（C3a 500 nM、IL-1β 10 ng/mL等）和时间（2小时、24小时）

阅读提示：Methods: Cell culture; TEER analysis

血管形态分析

切片厚度（30 μm）、Z-stack参数（40×油镜，步长0.5 μm，总厚度30 μm）、量化方法（IMARIS Surfaces和Filaments）

阅读提示：Methods: Immunostaining and image analysis

流式细胞术

组织消化方法（papain或Collagenase/Dispase）、抗体及稀释倍数（如anti-CD45-BV421 1:500）、采用CoBrA策略

阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis

数据统计

统计方法（1-way ANOVA with Tukey's post hoc test或Student's t test）、显著性阈值（P<0.05）

阅读提示：Statistics

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