工程化 CSF1R 变体库筛选
鉴定对 CSF1R 抑制剂具有抗性的 CSF1R 点突变。
基于共结晶结构设计 12 种 CSF1R 氨基酸替换，转导 Ba/F3 细胞，用 PLX3397 抑制实验评估突变体对抑制剂的抗性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
工程化一种抑制剂抗性的人 CSF1R 变体用于小胶质细胞替代
Engineering an inhibitor-resistant human CSF1R variant for microglia replacement
实验完整度
高包含体外细胞实验（Ba/F3、CIM、iMG）、体内动物模型（免疫缺陷小鼠）及转录组分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Ba/F3 细胞 条件永生化巨噬细胞（CIM） 人 iPSC 来源的小胶质细胞（iMG） 小鼠（Rag2/Il2rγ 免疫缺陷、CSF1h 人源化等）
重点核对
CSF1R 变体对 PLX3397 的 IC50 CSF1R 信号通路蛋白磷酸化水平 iMG 在 CSF1Ri 处理后的凋亡与增殖 体内移植后小胶质细胞的嵌合率和分布 xMG 对 LPS 刺激的炎症反应
摘要
Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) can replace endogenous microglia with circulation-derived macrophages but has high mortality. To mitigate the risks of HSCT and expand the potential for microglia replacement, we engineered an inhibitor-resistant CSF1R that enables robust microglia replacement. A glycine to alanine substitution at position 795 of human CSF1R (G795A) confers resistance to multiple CSF1R inhibitors, including PLX3397 and PLX5622. Biochemical and cell-based assays show no discernable gain or loss of function. G795A- but not wildtype-CSF1R expressing macrophages efficiently engraft the brain of PLX3397-treated mice and persist after cessation of inhibitor treatment. To gauge translational potential, we CRISPR engineered human-induced pluripotent stem cell-derived microglia (iMG) to express G795A. Xenotransplantation studies demonstrate that G795A-iMG exhibit nearly identical gene expression to wildtype iMG, respond to inflammatory stimuli, and progressively expand in the presence of PLX3397, replacing endogenous microglia to fully occupy the brain. In sum, we engineered a human CSF1R variant that enables nontoxic, cell type, and tissue-specific replacement of microglia.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在不依赖传统化疗或放疗的条件下实现高效、安全的小胶质细胞替代？
- 核心机制
- CSF1R 的 G795A 点突变通过空间位阻干扰抑制剂结合，保留 CSF1R 信号传导功能，从而抵抗 CSF1Ri 介导的细胞凋亡。
- 主要证据
- G795A-CSF1R 在 Ba/F3、CIM 及 iMG 中均表现出对多种 CSF1Ri 的抗性，并在体内移植后实现小胶质细胞的广泛替换；转录组分析显示 G795A 对 iMG 的基因表达影响很小。
- 研究意义
- 提供了一种无需传统化疗或遗传修饰宿主的小胶质细胞替代策略，有望用于治疗小胶质细胞相关疾病和递送治疗性蛋白。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证 G795A 的抗性和功能
验证 G795A 突变在巨噬细胞中对 CSF1Ri 的抗性及其对 CSF1 信号的影响。
将 G795A 转导至 CIM 和 BMDM，进行 IC50 测定、信号通路磷酸化检测（pCSF1R、pERK）和细胞增殖检测。
体内移植验证 G795A 巨噬细胞的嵌合能力
检验 G795A 巨噬细胞在 CSF1Ri 处理的小鼠中能否高效植入脑内。
将 G795A-CIM 或 BMDM 移植到新生或成年小鼠脑内，给予 PLX3397 处理后测量嵌合面积和细胞密度。
CRISPR 编辑 iPSC 并分化 iMG
在人 iPSC 中引入 G795A 突变并获得具有抗性的人小胶质细胞。
利用 CRISPR/Cas9 编辑 iPSC 的 CSF1R 基因，分化成 iMG，并用多种 CSF1Ri 处理评估细胞凋亡和转录组变化。
人源化小鼠移植验证 G795A-iMG 的体内功能
评估 G795A-iMG 在体内能否嵌合、增殖并维持正常功能。
将 G795A-iMG 移植到成年 MITRG 小鼠脑内，用 PLX3397 处理不同时间（10-60 天），分析嵌合程度、增殖和标志物表达，并用 LPS 刺激检验炎症反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | PLX3397 | MedChemExpress | -- |
| PLX5622 | MedChemExpress | -- | |
| Edicotinib | MedChemExpress | -- | |
| BLZ945 | MedChemExpress | -- | |
| 细胞培养 | Lenti-X 293T 细胞 | Takara Bio | -- |
| Ba/F3 细胞 | -- | -- | |
| Csf1r-/- 条件永生化巨噬细胞 | -- | -- | |
| CRISPR 编辑 | HiFi Cas9 核酸酶 V3 | IDTDNA | -- |
| 免疫染色 | 抗 IBA1 抗体 | Wako | -- |
| 山羊抗 IBA1 抗体 | Abcam | -- | |
| 抗 Tmem119 抗体 | Abcam | -- | |
| 抗 Ku80 抗体 | Abcam | -- | |
| 抗 P2RY12 抗体 | Millipore Sigma | -- | |
| 抗 CD45 抗体 | Abcam | -- | |
| 抗 MX1 抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗 Ki67 抗体 | Abcam | -- | |
| 抗 LGALS3 抗体 | R&D Systems | -- | |
| 信号通路检测 | 磷酸化 mCSF1R(Tyr723) 抗体 | CST | -- |
| 磷酸化 p44/42 MAPK (Erk1/2) 抗体 | CST | -- | |
| Western blot | Clarity Max ECL 底物 | Bio-Rad | -- |
| ChemiDoc MP 成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Incucyte Caspase-3/7 凋亡染料 | Sartorius | -- |
| 细胞活力检测 | LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 显微成像 | Olympus FX 1200 共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| Leica SP8 共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| RNA 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| TruSeq 链特异性总 RNA 文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| ClonTech SMART-seq V4 超微量样本文库制备试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| 显微成像 | Incucyte S3 活细胞成像系统 | Sartorius | 4647 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外耐药筛选 | PDX 浓度梯度、Ba/F3 细胞培养条件、CSF1 浓度、PLX3397 来源和批次 阅读提示：Materials and methods 中 'Inhibitor-resistant receptor screen' 部分 |
| CRISPR 基因编辑 | Cas9 核糖核蛋白复合物组成、sgRNA 序列、电转程序、筛选方法 阅读提示：Materials and methods 中 'CRISPR/Cas9 generation of G795 variants' 部分 |
| iMG 分化 | 分化方案、培养基成分、细胞因子浓度、分化时长 阅读提示：Materials and methods 中 'Hematopoietic progenitor cells (HPCs) and microglia differentiation from iPSCs' 部分 |
| 体内移植 | 小鼠品系（MITRG, Rag2-/-;Il2rγ-/-;CSF1h+/+ 等）、移植细胞类型和数量、PLX3397 剂量和给药方式、移植时间点、检测时间点 阅读提示：Materials and methods 中 'Mouse husbandry'、'Neonatal intracerebroventricular transplantation' 和 'Adult intracranial transplantation' 部分 |
| 微胶质细胞替换评估 | PLX3397 处理时间、嵌合率计算方法、免疫组化染色抗体、显微镜设置 阅读提示：Materials and methods 中 'Quantification of microglial replacement' 部分 |