全基因组功能缺失筛选
鉴定TLR7-IRF5信号通路中未知的关键调控因子。
在CAL-1细胞中构建MLKL-IRF5(122-498)-T2A-mCherry报告系统，通过CRISPR-Cas9基因敲除文库筛选，经CL307刺激后富集存活细胞，通过NGS分析sgRNA丰度。
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CCDC134通过内质网伴侣分子Gp96控制TLR的生物发生
CCDC134 controls TLR biogenesis through the ER chaperone Gp96
实验完整度
高包含基因组规模CRISPR筛选、体外细胞系敲除与回补、蛋白互作与质谱、小鼠巨噬细胞及原代成纤维细胞等多个独立证据层级，并进行了功能与机制验证。
主要模型
CAL-1人浆细胞样树突状细胞系 THP1单核细胞系及THP1 Dual报告细胞 U937细胞系 Hoxb8永生化小鼠骨髓祖细胞来源的巨噬细胞 人原代皮肤成纤维细胞
重点核对
TLR7/9激动剂R848、CL307、CpG-B的刺激浓度与时间 CRISPR-Cas9敲除CCDC134的sgRNA序列及敲除效率 CCDC134回补实验中的表达水平（野生型、Δ2-25、内质网靶向突变体） Gp96 N3Q突变体对过度糖基化的抑制效果 Doxycycline诱导CCDC134表达的浓度（0-10 ng/ml）及时间（24小时）
摘要
Toll样受体（TLR）是启动针对入侵病原体的免疫反应的核心。为了确保宿主防御，同时避免导致致病性炎症和自身免疫性疾病的异常激活，TLR受到多级调控机制的严密控制。通过在报告细胞系中进行功能缺失遗传筛选，该细胞系被设计为在TLR7诱导的IRF5激活时发生细胞死亡，我们在此鉴定出CCDC134是TLR反应的关键因子。CCDC134缺陷损害了内体溶酶体TLR诱导的NF-κB、MAPK和IRF5激活，以及下游促炎细胞因子和I型干扰素的产生。我们进一步证明CCDC134是内质网（ER）驻留的Gp96（HSP90B1/Grp94）相互作用因子，Gp96是质膜和内体溶酶体TLR折叠和运输所必需的ER伴侣分子。CCDC134控制Gp96的稳定性，因为其缺失导致Gp96过度糖基化和ER相关蛋白降解（ERAD）介导的清除。因此，CCDC134缺陷损害了TLR的折叠、成熟和运输，导致刺激时炎症反应减弱。总之，这项研究揭示了CCDC134是伴侣分子Gp96的中心调节因子，从而控制TLR的生物发生和反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TLR7-9信号通路存在哪些尚未识别的关键调控因子？
- 核心机制
- CCDC134作为内质网驻留蛋白，与Gp96结合并稳定其蛋白水平，防止Gp96过度糖基化及ERAD介导的降解，从而维持Gp96对TLR正确折叠和运输的功能。
- 主要证据
- 通过全基因组CRISPR-Cas9功能缺失筛选鉴定出CCDC134；在CAL-1、THP1、U937、Hoxb8巨噬细胞及原代成纤维细胞中敲除CCDC134均导致Gp96过度糖基化和降解，TLR成熟受损，信号通路激活减弱；Gp96 N3Q突变体可部分回补CCDC134缺陷的表型。
- 研究意义
- 揭示了CCDC134-Gp96通路控制质膜和内体溶酶体TLR介导的炎症反应，提示干预该过程可能在多种TLR驱动的过度炎症相关疾病中具有潜在价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CCDC134对TLR信号通路激活的影响
验证敲除CCDC134对TLR7/9介导的IRF5、NF-κB、MAPK通路和细胞因子产生的影响。
在CAL-1细胞中通过多种sgRNA敲除CCDC134，刺激后检测信号通路蛋白磷酸化水平及IL-6、IFNβ的产生。
鉴定CCDC134的亚细胞定位及对内体溶酶体TLR成熟的影响
确定CCDC134是否为内质网驻留蛋白，并评估其缺失对TLR7/8/9加工和成熟的影响。
通过免疫荧光、糖苷酶敏感性实验分析CCDC134定位；在CAL-1细胞中敲除CCDC134，检测TLR7、TLR8、TLR9的切割和成熟形式。
验证CCDC134与Gp96的相互作用及对Gp96稳定性的调控
验证CCDC134与Gp96相互作用并确定其调控Gp96稳定性的机制。
通过共免疫沉淀、质谱分析鉴定相互作用；敲除CCDC134后检测Gp96蛋白水平、糖基化状态及降解途径。
验证CCDC134作用依赖于Gp96
证明CCDC134通过Gp96影响TLR信号。
在CCDC134敲除细胞中回补野生型Gp96或Gp96 N3Q突变体，检测Gp96过度糖基化、TLR7加工及IL-6产生。
评估CCDC134缺失对多种TLR反应和Gp96客户蛋白的影响
确认CCDC134对质膜TLR及其他Gp96依赖性蛋白的普遍影响。
在THP1、U937、Hoxb8巨噬细胞及原代成纤维细胞中敲除CCDC134，检测TLR4、TLR5、TLR2等TLR反应，以及整合素、全蛋白质组分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Bioconcept | -- | |
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- | |
| CRISPR敲除 | pLentiCRISPRv2载体 | Addgene | 52961 |
| CRISPR筛选 | 人CRISPR敲除文库（Brunello） | Addgene | 73179-LV |
| 细胞刺激 | R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| CL307 | Invivogen | tlrl-c307 | |
| Pam2CSK4 | Invivogen | tlrl-pm2s-1 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | |
| 脂多糖 | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| 鞭毛蛋白 | Invivogen | tlrl-stfla | |
| cGAMP | Invivogen | tlrl-nacga23 | |
| 聚肌胞苷酸 | Invivogen | tlrl-pic | |
| C12-iE-DAP | Invivogen | tlrl-c12dap | |
| L18-MDP | Invivogen | tlrl-lmdp | |
| 肿瘤坏死因子-α | Peprotech | -- | |
| 白细胞介素-1β | Peprotech | -- | |
| CpG-B ODN2006 | IDT | -- | |
| 衣霉素 | Enzo | BML-CC104-0010 | |
| 抑制剂处理 | NMS-873 | Sigma-Aldrich | SML1128 |
| Z-VAD-FMK | Invivogen | HY-16658B | |
| 坏死磺酰胺 | Calbiochem | 480073 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Western blot | 抗磷酸化IRF5 (Ser446)抗体 | Abcam | AB309088 |
| 抗CCDC134抗体 | Santa Cruz | sc-393390 | |
| 抗Grp94 (Gp96)抗体 | Santa Cruz | sc-32249 | |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling | 3724 | |
| 抗V5抗体 | Cell Signaling | 13202 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-365062 | |
| 抗CNPY3抗体 | Sigma-Aldrich | HPA016560 | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 抗V5琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A7345 | |
| StrepTactin琼脂糖树脂 | IBA Lifesciences | 2-1201-002 | |
| 蛋白纯化 | Ni-琼脂糖6快流速 | Cytiva | 17-5318-01 |
| Superdex 200 10/300色谱柱 | Cytiva | GE28-9909-44 | |
| 流式细胞术 | 活死细胞近红外荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | L34975 |
| TruStain FcX（抗小鼠CD16/32）抗体 | BioLegend | 101320 | |
| 抗TLR2 APC抗体 | Miltenyi | 130-120-138 | |
| 抗TLR4 PE抗体 | BioLegend | 117605 | |
| 抗TLR5 PE抗体 | BioLegend | 148107 | |
| 抗TLR7 PE抗体 | BioLegend | 160003 | |
| 抗CD11a PE抗体 | BioLegend | 101107 | |
| 抗CD18 FITC抗体 | BioLegend | 101405 | |
| 抗CD44 PE抗体 | BioLegend | 103007 | |
| 抗CD49d APC抗体 | BioLegend | 103621 | |
| ELISA | 人IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7066-88 |
| 人TNFα ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7346-77 | |
| 小鼠TNFα ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7324-88 | |
| 人IFN-β ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY814-05 | |
| 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY823405 | |
| qPCR | Quick-RNA小型制备试剂盒 | Zymo Research | R1055 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 | |
| LightCycler 480 KAPA SYBR FAST | Roche | KK4611 | |
| 糖苷酶处理 | 内切糖苷酶H | NEB | P0702S |
| 肽N-糖苷酶F | NEB | P0704S | |
| 质谱 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TIMS-TOF Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| EvoSep One液相色谱系统 | EvoSep | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因组规模功能缺失筛选 | 筛选细胞系：CAL-1（稳定表达MLKL-IRF5(122-498)-T2A-mCherry） 阅读提示：参见Genome-scale loss-of-function screen和Fig. S1 F |
| 基因组规模功能缺失筛选 | CRISPR文库：Brunello文库，感染复数0.3，覆盖度1000x 阅读提示：参见Genome-scale loss-of-function screen |
| 基因组规模功能缺失筛选 | 刺激条件：CL307（2 μg/ml）处理6小时，重复6次 阅读提示：参见Genome-scale loss-of-function screen和Fig. S1 F |
| 细胞刺激与功能验证 | TLR7/9激动剂R848（2-5 μg/ml）、CL307（2 μg/ml）、CpG-B（2-5 μM）处理时间0-6小时（信号）或24小时（细胞因子） 阅读提示：参见Results章节和Fig. 1 C, E, H |
| 细胞培养 | 细胞系来源与培养条件：CAL-1（RPMI）、THP1（RPMI）、U937（RPMI）、Hoxb8（DMEM）、原代成纤维细胞（专用培养基） 阅读提示：参见Cell culture |
| 蛋白互作与糖基化检测 | 免疫共沉淀条件：E1A缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40） 阅读提示：参见Co-immunoprecipitation |
| 蛋白互作与糖基化检测 | 糖苷酶处理条件：EndoH或PNGase F（0.2 μl）处理30分钟 阅读提示：参见EndoH and PNGase F treatments |
| 抑制剂处理 | ERAD抑制剂NMS-873的浓度（1-10 μM）和时间（8小时） 阅读提示：参见Results章节和Fig. 3 H |
| 回补实验 | CCDC134回补使用的载体和表达水平（野生型、Δ2-25、内质网靶向突变体） 阅读提示：参见Results章节和Fig. 2 E-H |
| 回补实验 | Gp96 N3Q突变体（N445Q-N481Q-N502Q）的表达 阅读提示：参见Results章节和Fig. 4 H, I |