CD28介导的B7吞噬
验证CD28是否介导T细胞从APC获取B7配体
将Jurkat或原代T细胞与表达CD80-GFP或CD86-GFP的Raji细胞共培养15分钟，使用共聚焦显微镜、电镜和流式细胞术检测T细胞上B7的获得，并用28.3scFv阻断CD28验证其必要性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CTLA4通过顺式内吞作用清除T细胞内源性和吞噬获得的B7配体
CTLA4 depletes T cell endogenous and trogocytosed B7 ligands via cis-endocytosis
实验完整度
高包含多种独立证据层级：细胞系模型（Jurkat、Raji）、原代T细胞（Treg/Tconv）、患者来源PBMC，结合成像（共聚焦、电镜）、流式、功能实验（自刺激、反式清除）及机制验证（突变体、阻断抗体），符合高完整度标准。
主要模型
人Treg细胞 人Tconv细胞 Jurkat T细胞系 Raji B细胞系
重点核对
CD28和CTLA4在T细胞表面的表达水平 T细胞与APC共培养时间（15分钟） 阻断抗体浓度（ipilimumab 100 μg/ml，28.3scFv 20 μg/ml） TCR刺激剂（SEB 500 ng/ml或SEE 3 ng/ml） 填充细胞比例（30倍过量CD28−/− Jurkat）
摘要
CD28和CTLA4是T细胞共受体，它们竞争性结合B7配体CD80和CD86以控制适应性免疫应答。虽然CTLA4在抑制CD28共刺激信号中的作用已被充分证实，但其机制仍不清楚。在此，我们报道人T细胞通过CD28:B7结合，经吞噬作用获得抗原呈递细胞（APC）来源的B7配体和主要组织相容性复合体（MHC）。获得的MHC和B7使T细胞能够自身刺激，该过程受到CTLA4的细胞内在限制，CTLA4通过顺式内吞作用清除T细胞吞噬获得或内源性表达的B7配体。将此模型扩展到先前提出的人调节性T细胞（Treg）中CTLA4的外在功能，我们显示阻断CD28或CTLA4均减弱Treg介导的APC B7清除，表明吞噬作用和CTLA4介导的顺式内吞作用协同清除APC上的B7。我们的研究确立CTLA4作为细胞内在的分子沉淀池，限制T细胞表面B7的可用性，对靶向CTLA4的疗法具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CTLA4如何通过顺式内吞作用清除T细胞表面的B7配体，以及这一机制如何解释CTLA4的细胞内在和外在功能？
- 核心机制
- CTLA4通过顺式内吞作用清除T细胞表面经CD28介导吞噬获得的B7配体，限制B7的可用性，从而抑制T细胞自刺激；该过程由TCR信号促进，并依赖CTLA4的胞内结构域。
- 主要证据
- 共聚焦和电镜显示CD28介导B7吞噬，CTLA4在T细胞表面顺式结合并内化CD80/CD86；功能实验显示CTLA4阻断增强T细胞自刺激，且Treg介导的APC B7清除部分依赖CD28吞噬和CTLA4顺式内吞。
- 研究意义
- 该研究揭示CTLA4作为细胞内在分子沉淀池的功能，扩展了CTLA4调控范围，为CTLA4靶向治疗机制提供新见解，并可能解释治疗相关的自身免疫副作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CTLA4介导的顺式内吞作用
验证CTLA4是否通过顺式内吞作用清除T细胞表面的B7配体
将Treg/Tconv或Jurkat细胞与表达CD80/CD86的Raji共培养，然后加入填充细胞阻断T-T接触，使用流式细胞术检测CD80/CD86随时间的变化，并用ipilimumab阻断CTLA4观察效果。
评估T细胞自刺激
验证获得B7/MHC的T细胞是否能自刺激，以及CTLA4是否限制该过程
先用表达CD80-GFP的Raji预处理CD4+ T细胞，FACS分选后，在存在或不存在ipilimumab的条件下培养，通过IL-2 ELISA或细胞内细胞因子染色检测T细胞活化。
验证Treg介导的APC B7清除
确定CD28和CTLA4在Treg介导的APC B7清除中的作用
将人Treg与表达CD80-GFP或CD86-GFP的Raji共培养9小时，使用流式细胞术检测Raji上GFP信号的变化，并用ipilimumab或28.3scFv阻断。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | 10-041-CM |
| DMEM培养基 | Genesee Scientific | 25-501 | |
| 胎牛血清 | Omega Scientific | FB-02 | |
| 青霉素-链霉素 | GE Healthcare | SV30010 | |
| FreeStyle 293表达培养基 | Gibco | 12338-018 | |
| 支原体检测试剂盒 | Applied Biological Materials Inc. | G238 | |
| T细胞分离 | Mojosort人CD4 T细胞分离试剂盒 | BioLegend | -- |
| Dynabeads调节性CD4+/CD25+ T细胞试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 11363D | |
| T细胞培养 | Dynabeads人T细胞活化剂CD3/CD28 | Thermo Fisher Scientific | 11132D |
| Dynabeads人Treg扩增磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11129D | |
| 慢病毒转导 | 聚乙烯亚胺 | Thermo Fisher Scientific | NC1014320 |
| 重组蛋白表达 | Ni-NTA琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 88223 |
| 凝胶过滤标准品 | Bio-Rad | 1511901 | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 23210 | |
| 细胞标记 | VF405染料 | Biotium | 30068-T |
| 抗CD80抗体 | Proteintech | 66406-1-Ig | |
| 免疫金标记 | 10纳米金偶联二抗 | Ted Pella | 17110-1 |
| 细胞刺激 | OKT3抗体 | BioLegend | 317326 |
| 细胞因子检测 | 布雷菲德菌素A | BioLegend | 420601 |
| Cyto-Fast固定/破膜缓冲液套装 | BioLegend | 426803 | |
| 抗人IL-2抗体 | BioLegend | 503814 | |
| 抗人IFNγ抗体 | BioLegend | 502539 | |
| IL-2 ELISA试剂盒 | BioLegend | 431804 | |
| 细胞处理 | 伊匹单抗 | -- | -- |
| 28.3scFv | -- | -- | |
| 试剂 | 葡萄球菌肠毒素B | -- | -- |
| 葡萄球菌肠毒素E | -- | -- | |
| 成像 | 蔡司Airyscan共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 尼康转盘共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 电子显微镜 | 蔡司Libra透射电子显微镜 | Zeiss | -- |
| 流式细胞术 | LSRFortessa细胞分析仪 | BD Biosciences | -- |
| 试剂 | 可溶性CD80-Ig | Sino Biological | 10698-H02H-100 |
| CD86-Ig | BioLegend | 775606 | |
| 免疫染色 | Alexa Fluor 647抗人IgFc抗体 | BioLegend | 409320 |
| 细胞培养 | β-巯基乙醇 | -- | -- |
| 雷帕霉素 | -- | -- | |
| 白细胞介素-2 | -- | -- | |
| 慢病毒转导 | pMD2.G质粒 | -- | -- |
| psPAX2质粒 | -- | -- | |
| 流式染色 | Brilliant Violet 421抗FoxP3抗体 | BioLegend | 320123 |
| True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 | |
| 细胞培养 | SFFV启动子 | -- | -- |
| dSV40启动子 | -- | -- | |
| HaloTag配体JFX549 | -- | -- | |
| JFX646染料 | -- | -- | |
| 细胞标记 | SpyCatcher蛋白 | -- | -- |
| 细胞培养 | Myc标签抗体 | -- | -- |
| 试剂 | 抗HLA-DR抗体 | -- | -- |
| 抗CD86抗体 | -- | -- | |
| 抗CD80抗体（克隆2D10） | BioLegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系（Jurkat、Raji）来源及基因修饰状态；培养基类型（RPMI-1640、DMEM）及添加剂；培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and cultures |
| 共培养与吞噬实验 | 共培养时间（15分钟）；细胞比例（T细胞:Raji = 2:1）；阻断抗体浓度（ipilimumab 100 μg/ml，28.3scFv 20 μg/ml）；TCR刺激剂（SEB 500 ng/ml或SEE 3 ng/ml） 阅读提示：Materials and methods: Trogocytosis assays for measuring CD80/CD86 acquisition by Treg, Tconv, and Jurkat cells |
| 顺式内吞实验 | 填充细胞比例（30倍过量CD28−/− Jurkat）；培养时间（Treg/Tconv 9小时，Jurkat 1-3小时）；处理温度（37°C或冰上）；阻断剂类型及浓度 阅读提示：Materials and methods: Cell-intrinsic depletion of CD80 and CD86 in Treg, Tconv, and Jurkat cells |
| 自刺激实验 | 预处理时间（15分钟）；分选后培养时间（24-96小时）；IL-2检测方法（ELISA）；阻断剂浓度（ipilimumab 100 μg/ml） 阅读提示：Materials and methods: CD4+ T cells autostimulation and DC:CD4+ T cells coculture assays |
| 反式清除实验 | 共培养时间（9小时）；Treg与Raji比例（约2:1）；阻断剂浓度；SEB浓度（500 ng/ml） 阅读提示：Materials and methods: Coculture assays for measuring Treg-mediated CD80/CD86 trans depletion from Raji APCs |