建立MHC缺陷靶细胞模型
验证MHC缺陷细胞对NK细胞杀伤的敏感性。
利用CRISPR-Cas9敲除B2m和Ciita基因，生成B2m−/−Ciita−/− miPSCs和hiPSCs，并分化成内皮细胞。
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NK细胞中的SIRPα-CD47免疫检查点
The SIRPα-CD47 immune checkpoint in NK cells
实验完整度
高包含体内小鼠模型、体外细胞杀伤实验、转录组测序、ELISpot等多种证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠iPSC及iEC 人类iPSC及iEC K562肿瘤细胞 原代NK细胞和小鼠模型
重点核对
NK细胞经IL-2刺激后SIRPα表达上调 CD47过表达保护MHC缺陷靶细胞免受NK细胞杀伤 SIRPα阻断或缺陷可解除CD47介导的NK细胞抑制 CD47-SIRPα相互作用具有物种特异性 CD47表达需达到阈值（约3.5倍）才能抑制NK细胞
摘要
在此，我们报道了NK细胞中免疫检查点信号调节蛋白α（SIRPα）的存在和功能，并描述了如何对其进行调节以用于细胞治疗。NK细胞SIRPα在IL-2刺激后上调，以阈值依赖的方式与靶细胞CD47相互作用，并抵消其他刺激信号，包括IL-2、CD16或NKG2D。CD47的升高表达保护K562肿瘤细胞以及小鼠和人类MHC I类缺陷靶细胞免受SIRPα+原代NK细胞的攻击，但不保护其免受SIRPα− NKL或NK92细胞的攻击。SIRPα缺陷或抗体阻断增加了NK细胞的杀伤能力。在异种环境中，人类MHC缺陷细胞中恒河猴CD47的过表达阻止了恒河猴NK细胞的细胞毒性。SIRPα–CD47轴被发现具有高度物种特异性。总之，结果表明破坏SIRPα–CD47免疫检查点可能增强NK细胞抗肿瘤反应，而CD47的升高表达可能阻止NK细胞介导的异基因和异种组织杀伤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NK细胞是否表达SIRPα，以及CD47-SIRPα轴对NK细胞杀伤功能的调控作用。
- 核心机制
- NK细胞经IL-2刺激后上调SIRPα，CD47与SIRPα结合传递抑制信号，以阈值依赖方式抵消激活信号。
- 主要证据
- 小鼠和人类细胞实验表明，CD47过表达保护MHC缺陷靶细胞免受NK细胞杀伤，SIRPα缺陷或抗体阻断可解除抑制；异种实验显示物种特异性。
- 研究意义
- 破坏SIRPα-CD47免疫检查点可能增强NK细胞抗肿瘤反应，CD47工程化可用于生成通用型再生细胞产品。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内外NK细胞杀伤实验
评估CD47过表达对NK细胞杀伤的抑制作用。
用CFSE标记或Fluc标记的靶细胞，与NK细胞共培养或注射小鼠体内，通过流式或BLI检测杀伤。
验证SIRPα介导的抑制信号
确定CD47的抑制效应由NK细胞表达的SIRPα介导。
使用SIRPα阻断抗体、SIRPα缺陷小鼠或NK细胞系，检测CD47过表达靶细胞的杀伤情况。
测试CD47表达阈值
确定CD47抑制NK细胞所需的最小表达水平。
生成不同CD47表达水平的克隆，暴露于激活的NK细胞和巨噬细胞，观察杀伤情况。
评估物种特异性
检验CD47-SIRPα相互作用是否具有物种特异性。
交叉物种实验：小鼠、人类、恒河猴CD47与不同效应细胞组合，检测杀伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | KO DMEM培养基 | Gibco | -- |
| KnockOut血清替代物 | Gibco | -- | |
| Essential 8 Flex培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| B-27无胰岛素添加剂 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | CHIR-99021 | Selleckchem | -- |
| 小鼠血管内皮生长因子 | R&D Systems | -- | |
| 小鼠碱性成纤维细胞生长因子 | R&D Systems | -- | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SB 431542 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | TrypLE消化液 | Gibco | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| Versene | Gibco | -- | |
| 细胞分选 | FACSAria II流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞杀伤实验 | xCELLigence SP/MP平台 | ACEA Biosciences | -- |
| 细胞培养 | E-板 | ACEA Biosciences | -- |
| 细胞杀伤实验 | 胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| D-荧光素 | Promega | -- | |
| 成像检测 | Ami HT成像系统 | Spectral Instruments Imaging | -- |
| 细胞培养 | Ficoll分离液 | -- | -- |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素2 | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素15 | PeproTech | -- | |
| 聚肌胞苷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 动物实验 | 白喉毒素 | Lystlab | -- |
| 流式分析 | 抗Sirpα抗体（克隆P84） | BD Biosciences | -- |
| 重组小鼠Cd47蛋白Fc嵌合体 | R&D Systems | 1866-CD-050 | |
| FITC标记抗人IgG1二抗 | -- | -- | |
| CFSE | Thermo Fisher | -- | |
| DiO | Invitrogen | -- | |
| DiD | Invitrogen | -- | |
| Vybrant多色细胞标记试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| ELISpot | 丝裂霉素 | -- | -- |
| RT-PCR | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| TopTaq DNA聚合酶 | Qiagen | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| QuantStudio6实时荧光定量PCR仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 流式分析 | PE标记抗SIRPα抗体（克隆15-414） | BioLegend | -- |
| 重组CD47蛋白Fc嵌合体 | Abcam | ab216207 | |
| FITC标记抗CD47抗体（克隆CC2C6） | BioLegend | -- | |
| FITC标记小鼠IgG1,κ同型对照（MOPC-21） | BioLegend | -- | |
| 细胞杀伤实验 | 抗Cd47阻断抗体（克隆MIAP301） | BioXCell | -- |
| 抗CD47阻断抗体（克隆B6.H12） | BioXCell | -- | |
| 抗Sirpα阻断抗体（克隆P84） | BioLegend | -- | |
| 抗SIRPα阻断肽 | MyBioSource | MBS822365 | |
| 小鼠FcR阻断剂 | Miltenyi | 130-092-575 | |
| 人FcR阻断剂 | Miltenyi | 130-059-901 | |
| 抗Pirb抗体 | MyBioSource | MBS1489822 | |
| 抗LILRB1抗体（克隆GHI/75） | Abcam | -- | |
| 抗CD16抗体（克隆3G8） | BioLegend | -- | |
| 抗NKG2D抗体（克隆149810） | R&D Systems | -- | |
| 抗SIRPα抗体（克隆2H7E2） | antibodies-online | -- | |
| 抗CD56抗体（克隆NCAM1/784） | Abcam | -- | |
| 细胞培养 | 脂质体转染试剂 | -- | -- |
| 细胞分选 | 抗CD15单抗偶联磁珠 | Miltenyi | -- |
| MagniSort小鼠NK细胞富集试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| CD49b MACS分选 | Miltenyi | -- | |
| CD3 MACS分选 | Miltenyi | -- | |
| 细胞培养 | 恒河猴IL-2 | MyBioSource | -- |
| 恒河猴M-CSF | Biorhyt | -- | |
| 动物实验 | NSG小鼠 | Jackson Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NK细胞激活 | IL-2刺激浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: NK cell culture, Human NK cell isolation; Figure S3 |
| CD47过表达水平 | CD47表达需达到约3.5倍以上 阅读提示：Results: CD47 delivers a threshold-dependent inhibitory signal; Figure 5 |
| 效应细胞类型 | 是否表达SIRPα 阅读提示：Results: SIRPα transmits the inhibitory CD47 signal; Figure 4 |
| 物种匹配性 | CD47和效应细胞需同种 阅读提示：Results: The CD47–SIRPα interaction is highly species specific; Figure 3 |