CD123变体的计算设计
基于结构信息设计能够破坏CSL362结合但保持CD123功能的氨基酸替换
利用已知晶体结构进行接触分析和统计能量计算，选择候选变体
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表位工程化的人造血干细胞免受CD123靶向免疫治疗的影响
Epitope-engineered human hematopoietic stem cells are shielded from CD123-targeted immunotherapy
实验完整度
高包含体外细胞系功能验证、HSPC编辑与分化研究、体内移植模型（NBSGW和NSG-SGM3小鼠）以及多层级的安全性与机制验证（如BLI、DSF、pSTAT5、CFU、二次移植）。
主要模型
HEK-293细胞系 TF-1细胞系 人CD34+ HSPCs NBSGW和NSG-SGM3小鼠模型
重点核对
CD123变体的选择：E51K和E51T，通过流式细胞术验证MIRG123结合缺失和6H6结合保持 功能验证：pSTAT5信号分析确认IL-3信号传导，CFU分析确认分化能力 体内验证：在NBSGW小鼠中移植后的嵌合率和多谱系分化分析，以及二次移植实验 安全性：通过计算预测、Discover-Seq和CAST-Seq评估脱靶活性 抗肿瘤效果：与MOLM-14和PDX细胞的共培养杀伤试验
摘要
本工作证明，在造血干细胞的细胞表面蛋白CD123中引入单个氨基酸替代可保护它们免受靶向免疫治疗的影响。移植经修饰的干细胞可能使移植后治疗能够减少疾病复发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过表位工程化修饰CD123，使造血干细胞在保持功能的同时，免受CD123靶向免疫治疗的影响？
- 核心机制
- 通过在CD123的Csl362抗体结合位点引入单个氨基酸替换（如E51K、E51T），可完全阻断抗体结合，同时保留IL-3结合和信号传导，从而在体外和体内保护HSPCs免受免疫治疗攻击。
- 主要证据
- 体外实验显示，E51K和E51T变体在HEK-293细胞和HSPCs中阻断ADCC、TCE和CAR T细胞的杀伤；TF-1和HSPCs功能实验表明IL-3信号传导保持；体内NBSGW小鼠移植实验显示正常植入和多谱系分化，二次移植确认长期重建。
- 研究意义
- 该策略可能使肿瘤选择性免疫治疗在移植后得以进行，并可能适用于其他靶点和细胞类型，从而产生新的治疗可能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外结合及功能验证
验证变体对MIRG123结合缺失但蛋白表达和IL-3结合保持
在HEK-293细胞中稳定表达变体，通过流式细胞术检测抗体结合；BLI检测蛋白结合亲和力；DSF分析热稳定性
体外免疫治疗杀伤实验
验证变体在ADCC、TCE和CAR T细胞杀伤实验中的保护效果
使用ADCC报告实验、TCE共培养实验和123CAR T细胞杀伤实验，检测特异性杀伤和T细胞活化
HSPCs的基因编辑和功能验证
在CD34+ HSPCs中引入E51K和E51T变体，并验证其功能
使用CRISPR/Cas9 HDR或AAV6编辑HSPCs，通过流式细胞术检测编辑效率，pSTAT5信号分析IL-3信号，CFU分析分化潜力
体内移植和长期重建实验
评估编辑HSPCs的植入和长期重建能力
将编辑HSPCs移植到NBSGW小鼠，16周后分析嵌合和多谱系分化，并二次移植到NSG-SGM3小鼠评估LT-HSC功能
肿瘤选择性杀伤实验
验证编辑HSPCs对CAR T、TCE和ADC的抵抗性，同时保留肿瘤杀伤
将编辑HSPCs与AML细胞系和PDX细胞及效应细胞共培养，评估HSPC存活和肿瘤杀伤
脱靶和染色体异常分析
评估gRNA的特异性
使用Cas-OFFinder计算预测、Discover-Seq、rhAmpSeq验证和CAST-Seq
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质稳定性分析 | SYPRO Orange | Sigma-Aldrich | S5692 |
| 细胞增殖检测 | CellTiter-Glo 2.0 | Promega | G9241 |
| ADCC报告实验 | ADCC报告生物测定，V变异体 | Promega | G7015 |
| 细胞系培养 | RPMI-1640培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PowerCHO 2无血清培养基 | Lonza | BELN12-771Q | |
| GlutaMAX | Gibco | -- | |
| HT补充物 | Gibco | 41065012 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 遗传霉素G418 | BioConcept | -- | |
| 细胞培养添加剂 | UM171 | StemCell Technologies | -- |
| 细胞因子 | 干细胞因子 | Miltenyi | -- |
| 促血小板生成素 | Miltenyi | -- | |
| Fms样酪氨酸激酶3配体 | Miltenyi | -- | |
| 白细胞介素-3 | Miltenyi | -- | |
| 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Bio-Techne | 215-GM | |
| T细胞培养 | 白细胞介素-2 | University Hospital Basel | -- |
| 白细胞介素-7 | R&D Systems | -- | |
| 白细胞介素-15 | R&D Systems | -- | |
| 抗体 | MIRG123 | -- | -- |
| 6H6 | -- | -- | |
| Alexa 647小鼠抗人Stat5 (pY694) | BD Biosciences | -- | |
| BV650小鼠抗人CD123克隆6H6 | BioLegend | -- | |
| 抗人Fc捕获生物传感器 | Sartorius | 18-5060 | |
| BLI检测 | 链霉亲和素捕获生物传感器 | Sartorius | 18-5019 |
| 生物素化试剂盒Type B | Abcam | ab201796 | |
| IL-3（重组） | Sino Biological | 11858-H08H | |
| 蛋白表达 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966 |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA柱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白A柱 | -- | -- | |
| DNA提取 | QuickExtract | Biosearch technologies | QE09050 |
| PCR | Kapa Hifi热启动预混液 | Roche | F-530-L |
| GoTaq G2 Green预混液 | Promega | M782B | |
| T细胞分离 | EasySep人T细胞分离试剂盒 | StemCell Technologies | 17951 |
| SepMate管 | StemCell Technologies | -- | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | -- | |
| T细胞激活 | CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 电穿孔 | Neon转染系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 4D-Nucleofector系统 | Lonza | -- | |
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi | -- | |
| 基因组编辑 | SpyFi Cas9 | Aldevron | -- |
| 重组Cas9 | University of California Berkeley | -- | |
| CD123 sgRNA | Synthego Corporation | -- | |
| CCR5 sgRNA | Synthego Corporation | -- | |
| CD123-E51K供体rAAV6 | SignaGen Laboratories | -- | |
| CD123-E51T供体rAAV6 | SignaGen Laboratories | -- | |
| AAVpro纯化试剂盒 | TakaRa | -- | |
| ssDNA HDRT | IDT | -- | |
| TRAC HDRT | GenScript | -- | |
| 细胞培养 | HSC-Brew GMP基础培养基 | Miltenyi | -- |
| StemPro培养基 | Gibco | -- | |
| SCGM培养基 | CellGenix | -- | |
| 甲基纤维素培养基 | StemCell Technologies | -- | |
| HSPC培养 | 人血清白蛋白 | -- | -- |
| ADCC报告实验 | Bio-Glo荧光素酶检测试剂 | Promega | -- |
| BLI检测 | Octet Red96e | ForteBio | -- |
| Octet R8 | Sartorius | -- | |
| 荧光检测 | PHERAstart FSX | BMG LABTECH | -- |
| Synergy H1 | BioTek | -- | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter Life Sciences | -- | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | -- | |
| 流式分选 | BD FACSAria | BD Biosciences | -- |
| BD FACSMelody细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞培养 | Freestyle CHO-S细胞 | Thermo Fisher Scientific | R80007 |
| TF-1细胞 | DSMZ | ACC334 | |
| MOLM-14细胞 | DSMZ | ACC777 | |
| K562细胞 | ATCC | CCL243 | |
| HEK-293细胞 | M. Zavolan | -- | |
| OCI-AML-2细胞 | DSMZ | -- | |
| OCI-AML-3细胞 | DSMZ | -- | |
| 质粒构建 | pCMV3载体 | Sino Biological | HG10518-M |
| AbVec2.0-IGHG1 | Addgene | 80795 | |
| AbVec1.1-IGKC | Addgene | 80796 | |
| 细胞转染 | MI-Luciferase-IRES-mCherry | Addgene | 75020 |
| ELISA检测 | ELISA MAX标准套装人IFNγ试剂盒 | BioLegend | -- |
| 测序分析 | Illumina MiSeq | Illumina | -- |
| Illumina NextSeq | Illumina | -- | |
| Illumina MiniSeq | Illumina | -- | |
| 流式分析 | CellTracker Violet | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞培养 | HEPES | Sigma-Aldrich | -- |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco Life Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CD123变体设计 | 计算设计方法、PDB结构、ΔE评分标准 阅读提示：Materials and methods - Structural dataset and computational design of CD123 protein variants |
| 体外结合实验 | HEK-293细胞中变体表达、MIRG123和6H6抗体结合检测 阅读提示：Figure 2 legend, Materials and methods - Flow cytometry and cell sorting |
| 体外杀伤实验 | ADCC实验效应靶比、TCE浓度、CAR T细胞效应靶比 阅读提示：Materials and methods - ADCC assay, In vitro TCE-mediated killing assay, In vitro human CD123CAR killing assay |
| HSPC编辑 | HDRT序列、电穿孔参数、编辑后培养条件 阅读提示：Materials and methods - Non-virally CRISPR/Cas9 mediated engineering of HSPCs, CD123 and CCR5 gene editing procedure |
| HSPC功能验证 | pSTAT5检测、CFU分析、体外分化条件 阅读提示：Materials and methods - pSTAT5 staining, Methylcellulose CFU assay, Differentiation of non-virally edited HSPCs in vitro |
| 体内移植 | 小鼠品系、细胞注射量、观察时间点 阅读提示：Materials and methods - Mice |
| 安全性分析 | gRNA脱靶预测参数、Discover-Seq、CAST-Seq分析方法 阅读提示：Materials and methods - Computational off-target prediction, Discover-Seq, CAST-Seq |