验证IL-24在Th17细胞中的表达
检测不同T辅助细胞亚型中IL-24的表达水平。
从小鼠脾脏分选naive T细胞，分别分化为Th1、Th2、iTreg和Th17（非致病性和致病性），通过RT-qPCR和ELISA检测IL-24 mRNA和分泌水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
IL-24在小鼠中内在地调节Th17细胞的致病性
IL-24 intrinsically regulates Th17 cell pathogenicity in mice
实验完整度
高包含体外T细胞分化、CRISPR/Cas9基因编辑、siRNA敲低、体内MBMC和过继转移EAE模型，以及RNA-seq、ChIP-PCR、Western blot等机制验证。
主要模型
小鼠naive CD4+ T细胞体外分化的Th17细胞 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型
重点核对
Il24基因敲除小鼠（Il24−/−） IL-20Rβ缺失（Il20rb−/−）小鼠 CRISPR/Cas9介导的Il24基因编辑 IL-24特异性siRNA敲低 混合骨髓嵌合（MBMC）小鼠和混合过继转移EAE
摘要
在某些情况下，Th17反应与严重的免疫病理相关。限制致病性效应功能的T细胞内在机制已在1型和2型反应中得到描述，但在Th17细胞中研究较少。在此，我们报告了一种控制Th17细胞致病性的细胞内在反馈机制。Th17细胞产生IL-24，促使其分泌IL-10。IL-24的IL-10诱导功能不依赖于Th17细胞表面的IL-24受体。相反，IL-24被招募到线粒体内膜，在那里它与NADH脱氢酶（泛醌）1 α亚复合物亚基13（也称为Grim19）相互作用，Grim19是呼吸链复合物I的组成部分。Grim19和IL-24共同促进STAT3在线粒体区室的积累。我们提出，IL-24引导的线粒体STAT3构成一个变阻器，以减弱细胞核中过度的STAT3偏移，这进而可能有助于Th17细胞产生强大的IL-10反应，并限制实验性自身免疫性脑脊髓炎的免疫病理。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Th17细胞是否存在细胞内在的负反馈调节机制，通过IL-24控制其致病性？
- 核心机制
- IL-24以不依赖其表面受体的方式，与线粒体内膜复合物I亚基Grim19相互作用，促进STAT3向线粒体转位，形成线粒体STAT3库，减少核内STAT3的瞬时偏移，从而增强IL-10的产生并限制免疫病理。
- 主要证据
- Il24−/− Th17细胞IL-10产生减少；Il20rb−/−和中和抗体不影响IL-10；非分泌型IL-24可恢复IL-10；线粒体STAT3在Il24−/−中减少；EAE中Il24−/−小鼠病情加重且CNS炎症浸润增加。
- 研究意义
- IL-24构成Th17细胞内在的负调控环路，为调控Th17驱动的自身免疫和慢性炎症相关癌症提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
研究IL-24表达的调控机制
确定STAT3和IL-1β对IL-24表达的影响。
使用Stat3缺陷T细胞分化Th17检测IL-24表达；通过放线菌素D实验和3'UTR报告基因检测IL-1β对Il24 mRNA稳定性的影响。
验证IL-24对IL-10的细胞内在调节
确定IL-24是否以T细胞内在方式调节IL-10产生。
利用Il24−/−、Il24+/− T细胞以及CRISPR/Cas9和siRNA敲低IL-24，检测Th17分化中IL-10的表达；同时使用Il20rb−/−、外源IL-24和中和抗体以排除受体依赖机制。
验证IL-24在体内对IL-10的调节
在体内模型中验证IL-24对Th17细胞IL-10产生的细胞自主作用。
生成混合骨髓嵌合体并诱导EAE，以及混合过继转移WT和Il24−/− 2D2 Th17细胞至Rag1−/−小鼠，然后分析脾脏和CNS中IL-10和GM-CSF的表达。
验证IL-24的细胞内功能
测试细胞内IL-24是否足以调节IL-10产生，并确认其线粒体定位。
用表达非分泌型IL-24（IL-24t）的质粒转染Il24−/− T细胞，检测IL-10产生；通过共聚焦显微镜观察IL-24t与线粒体的共定位。
机制验证：IL-24促进STAT3向线粒体转位
验证IL-24与Grim19相互作用并促进STAT3在线粒体积累的机制。
分离线粒体和核组分，通过Western blot检测STAT3水平；用Grim19抗体免疫沉淀线粒体组分检测STAT3结合；在IL-2维持条件下检测核STAT3衰减动力学。
转录组分析IL-24对STAT3靶基因的影响
评估IL-24缺失对Th17细胞转录组和STAT3靶基因表达的整体影响。
对WT和Il24−/− Th17细胞进行bulk RNA-seq，鉴定差异表达基因；通过ChIP-PCR检测STAT3在Il10座位的富集；进行GSEA分析。
体内功能验证：EAE严重性
检验IL-24缺乏对Th17介导的自身免疫疾病（EAE）的影响。
对Il24−/−、Il19−/−、Il20rb−/−及抗体处理的小鼠诱导EAE，并记录疾病评分；进行过继转移实验以确认T细胞内在作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和分化 | RPMI/完全DMEM培养基 | -- | -- |
| 重组小鼠IL-6 | Miltenyi | 130-095-067 | |
| 重组人TGF-β | Miltenyi | 130-095-067 | |
| 重组小鼠IL-23 | Miltenyi | 130-096-676 | |
| 重组小鼠IL-1β | Miltenyi | 130-101-681 | |
| 重组小鼠IL-27 | BioXCell | 2799-ML | |
| 抗CD3抗体 | BioXCell | BE0001-1 | |
| 抗CD28抗体 | BioXCell | BE0001-1 | |
| 抗IL-4抗体 | BioXCell | BE0045 | |
| 抗IL-12p40抗体 | BioXCell | BE0051 | |
| 重组小鼠IL-4 | Miltenyi | 130-097-761 | |
| 重组小鼠IL-12 | R&D Systems | 419-ML | |
| 重组人IL-24 | R&D Systems | 1965-IL | |
| 重组小鼠IL-24 | R&D Systems | 7807-ML | |
| 抗IL-24抗体 | R&D Systems | MAB2786 | |
| 同型对照抗体（大鼠IgG2a） | BioXCell | BE0089 | |
| 山羊IgG同型对照 | R&D Systems | AB-108C | |
| 重组小鼠IL-2 | Miltenyi | 130-094-055 | |
| 细胞增殖检测 | CellTrace Violet增殖染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ELISA | IL-24 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD4抗体 | BD Biosciences | -- |
| 抗IL-10抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗IL-17A抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗IFN-γ抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗GM-CSF抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗Foxp3抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗CD45.1抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD45.2抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗hNGFR抗体 | BioLegend | -- | |
| 活死细胞染料 | Invitrogen | -- | |
| GolgiStop | BD Biosciences | -- | |
| 细胞处理 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine LTX转染试剂与PLUS试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15338100 |
| 核转染 | Amaxa P3原代细胞4D-Nucleofector X试剂盒L | Lonza | V4XP-3024 |
| RNA干扰 | 靶向IL-24的Accell siRNA | Dharmacon | E-050687-00-0005 |
| 对照siRNA | Dharmacon | D-001910-01-05 | |
| 质粒构建 | pIRES-eGFP载体 | Clontech | 6029-1 |
| mRuby2-N1载体 | Addgene | 54614 | |
| pXPG质粒 | Addgene | 71248 | |
| pMIR-GLO双荧光素酶miRNA靶标表达载体 | Promega | E1330 | |
| WB/免疫沉淀 | 线粒体分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89874 |
| 抗Grim19抗体 | -- | -- | |
| 蛋白A/G Sepharose珠子 | Abcam | Ab193262 | |
| NuPAGE凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0302BOX | |
| Super Block封闭液 | Thermo Fisher Scientific | 37581 | |
| SuperSignal West Femto底物 | Thermo Fisher Scientific | 34095 | |
| RT-qPCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| Direct-zol RNA微量制备 | Zymo Research | -- | |
| TaqMan逆转录试剂 | Applied Biosystems | -- | |
| TaqMan探针 | Thermo Fisher Scientific | Il10: Mm00439614_m1 | |
| ChIP-PCR | SimpleChIP酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signaling | -- |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 蛋白酶K | Cell Signaling | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Plus微量试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| Maxima逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | EP0742 | |
| NEB UltraII FS试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| EAE诱导 | MOG(35-55)肽 | Auspep | -- |
| 完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 百日咳毒素 | Sigma-Aldrich | P7208 | |
| EAE治疗 | 抗IL-24抗体 | R&D Systems | MAB2786 |
| 免疫组织化学 | 抗CD3抗体 | DCS | C1597R0 |
| 抗MAC-3抗体 | -- | -- | |
| 抗B220抗体 | eBioscience | -- | |
| CNS细胞分离 | 胶原酶D | Roche Diagnostics | 11088866001 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche Diagnostics | 04716728001 | |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 细胞分离 | CD90.2磁珠 | Miltenyi | 130-121-278 |
| naive CD4+ T细胞分选试剂盒 | Miltenyi | 130-104-453 | |
| 细胞培养 | Retronectin | Takara BioScience | T100B |
| MitoTracker Green线粒体染料 | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 流式细胞仪 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 分选 | FACS Aria III细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞计数 | Guava easyCyte 5HT流式细胞仪 | Merck | -- |
| 荧光素酶检测 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| Mithras LB 940酶标仪 | Berthold Technologies | -- | |
| RNA-seq数据处理 | Drop-seq流程 | -- | -- |
| 数据分析 | GenePattern软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| T细胞分化和培养 | naive T细胞分选标记（CD4+CD44lowCD62LhighCD25−）、细胞因子浓度（如TGF-β 2 ng/ml, IL-6 50 ng/ml）、培养时间（3天）、抗体（anti-CD3 4 μg/ml, anti-CD28 2 μg/ml） 阅读提示：Materials and methods: Isolation of naive T lymphocytes and T cell cultures |
| 基因编辑 | CRISPR/Cas9系统（Cas9转基因小鼠、gRNA序列、转导方法）和siRNA敲低（靶序列、浓度1 μM） 阅读提示：Materials and methods: Retroviral transduction and transfection, RNA interference |
| 体内EAE模型 | MOG(35-55)肽剂量200 μg、CFA中结核分枝杆菌H37Ra量500 μg、PTx剂量200 ng、免疫途径（皮下、静脉/腹腔）、疾病评分标准 阅读提示：Materials and methods: Induction of EAE |
| 过继转移 | 供体免疫方案、T细胞体外再刺激条件（MOG 35 μg/ml, TGF-β 0.25 ng/ml, IL-6 5 ng/ml, IL-23 6.5 ng/ml, anti-IFN-γ 10 μg/ml）、转移细胞数量（7×10^6）、受体品系 阅读提示：Materials and methods: Adoptive transfer of T cells |
| 分子机制检测 | 线粒体分离方案、免疫沉淀抗体（anti-Grim19）、Western blot抗体（anti-STAT3）、核组分制备、ChIP-PCR抗体和引物序列 阅读提示：Materials and methods: Subcellular fractionation, immunoprecipitation, and Western blotting, ChIP-PCR |