胸腺组织的获取、培养与冷冻保存
建立并验证培养胸腺组织冷冻保存的方法，确保解冻后组织活力。
从新生大鼠、猪或人婴儿获取胸腺，切成片状，分别培养8-14天。培养后的胸腺组织用含10%二甲基亚砜的血清进行冷冻，置于-80°C后转至液氮保存，使用前在37°C水浴快速解冻。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过将冷冻保存的培养胸腺组织植入无胸腺受者体内重建胸腺生成功能
Reconstitution of thymopoiesis via implantation of cryopreserved cultured thymus tissue into athymic recipients
实验完整度
高研究包含大鼠、猪体内同种移植模型及人胸腺组织体外评估，并进行了功能（T细胞重建、sjTREC）和机制（组织学、CCL21）验证。
主要模型
先天性无胸腺裸大鼠 胸腺切除、T细胞耗竭的尤卡坦小型猪 培养的人胸腺组织
重点核对
大鼠胸腺培养8-9天，猪和人胸腺培养14天 冷冻保存：90%热灭活血清+10%二甲基亚砜，冷冻至-80°C后转移至液氮，37°C水浴快速解冻 大鼠cCTTI植入肾囊下，猪cCTTI植入股四头肌 猪使用奈拉滨预处理，依据体表面积给药，连续5天静脉输注 使用sjTREC分子标记确认胸腺新输出
摘要
将培养的同种异体胸腺组织（CTTI）植入无胸腺的人类受者体内，可产生具有供体耐受性的功能性受者来源初始T细胞。目前，CTTI总是在胸腺获取后12至21天内进行，以避免培养相关变化对其重建潜力造成不利影响。我们在此证明，培养的胸腺组织可以冷冻保存，并仍保持其活力和重建潜力。将冷冻保存的培养大鼠胸腺组织（cCTTI）植入先天性无胸腺大鼠的肾囊下，可导致胸腺植入物被T细胞祖细胞定植，外周血中出现基因型为受者来源的初始T细胞。同样，将猪胸腺cCTTI植入胸腺切除且T细胞耗竭的猪的股四头肌中，可实现植入胸腺的完全重建。经过类似培养和冷冻保存的人胸腺组织，继续满足与新鲜培养胸腺组织相同的植入质量标准。有必要开展临床试验，以测试cCTTI将当前获取与植入之间的时间关联解耦的潜力。这将把免疫重建和耐受诱导的益处扩展到更广泛的患者群体。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 培养的胸腺组织经冷冻保存后是否仍保持活力并具备重建免疫的功能潜力？
- 核心机制
- 冷冻保存的培养胸腺组织在解冻后仍含有存活的胸腺上皮细胞和成纤维细胞，能够合成趋化因子CCL21，并可被T细胞祖细胞定植，建立功能性胸腺微环境，支持胸腺生成和初始T细胞的输出。
- 主要证据
- 大鼠和猪体内移植后，冷冻保存的胸腺组织均显示出正常的胸腺结构重建，产生受者来源的初始T细胞，并通过检测外周血中sjTREC增加得到验证；人胸腺组织在冷冻解冻后仍表达CK14和CCL21，满足植入质量标准。
- 研究意义
- 作者提出，冷冻保存培养胸腺组织可使CTTI的植入时间不受组织获取时间限制，有望通过胸腺组织库改善先天性胸腺功能不全的治疗，并扩展CTTI在免疫重建和耐受诱导中的适用范围。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
大鼠体内植入验证
评估冷冻保存的培养胸腺组织在先天性无胸腺大鼠中的免疫重建能力。
将新鲜胸腺、培养胸腺、冷冻保存的培养胸腺分别植入裸大鼠肾囊下。10个月后通过组织学和流式细胞术分析植入物及外周血，评估T细胞生成。
猪体内植入验证
验证冷冻保存的培养胸腺组织在胸腺切除且T细胞耗竭的猪中重建胸腺生成的能力。
对9-12周龄雌性尤卡坦猪进行胸腺切除，并使用奈拉滨进行预处理。将自体培养的胸腺组织（直接培养或冷冻保存后）植入股四头肌。通过流式细胞术、组织学和sjTREC检测评估免疫重建。
人胸腺组织的体外评估
确认冷冻保存的培养人胸腺组织解冻后仍满足临床植入质量标准。
将培养的人胸腺组织冷冻保存并解冻，通过组织学染色和免疫组化评估胸腺上皮细胞、CK14表达、增殖细胞以及与趋化因子CCL21相关的活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胸腺培养 | Ham's F-12培养基 | -- | -- |
| HEPES | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| 可吸收明胶海绵 | -- | -- | |
| 冷冻保存 | 二甲基亚砜 | -- | 67-68-5 |
| Cool Cell LX程序降温盒 | Corning | -- | |
| 免疫评估（大鼠） | FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| CD3抗体 | Dako | A0452 | |
| 细胞角蛋白抗体 | Invitrogen | 180059 | |
| AIRE抗体 | Abcam | -- | |
| MHC II类抗体 | ThermoFisher | -- | |
| 免疫评估（猪） | Cytek Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- |
| 氯化铵-钾裂解缓冲液 | Gibco | -- | |
| 10%中性缓冲福尔马林 | Avantor/VWR | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| CD3单克隆抗体BB23-8E6-8C8 | BD Biosciences | 561478 | |
| 磁珠 | Miltenyi | -- | |
| 蛋白酶K | Roche | -- | |
| Platinum Taq DNA聚合酶 | Thermo | -- | |
| CFX Connect实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| pCR2.1-TOPO载体 | Invitrogen | -- | |
| CD3多克隆抗体 | Dako | A0452 | |
| Ki-67多克隆抗体 | Abcam | ab15580 | |
| CCL21多克隆抗体 | SigmaAldrich | HPA051210 | |
| 广谱细胞角蛋白多克隆抗体 | Invitrogen | 180059 | |
| 细胞角蛋白14抗体 | Invitrogen | LL002 | |
| 末端脱氧核苷酸转移酶抗体 | Invitrogen | 7UNA8U6 | |
| 人胸腺组织评估 | 广谱细胞角蛋白抗体 (AE1/AE3) | Leica | -- |
| 细胞角蛋白14抗体 (LL02) | Leica | -- | |
| CD3抗体 (LN10) | Leica | -- | |
| Ki-67抗体 (MIB-1) | Dako | -- | |
| CCL21多克隆抗体 | Sigma Aldrich | HPA051210 | |
| 大鼠模型 | 异氟烷 | -- | -- |
| 猪模型 | 奈拉滨 | Meitheal Pharmaceuticals or Novartis | -- |
| CCL21检测 | CCL21夹心酶免疫测定试剂盒 | Biovenic | EK10F22 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 胸腺培养 | 大鼠胸腺培养8-9天，猪和人胸腺培养14天；培养基为Ham's F12 + 10% FBS（大鼠另含HEPES、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素）；每日换液 阅读提示：Methods 2.2节 |
| 胸腺冷冻保存 | 冷冻液为90%热灭活血清 + 10% DMSO；程序降温至-80°C后转移至液氮；解冻为37°C水浴快速解冻，并逐步洗去冷冻保护剂 阅读提示：Methods 2.2节 |
| 大鼠体内植入 | 大鼠品系、年龄（6-7周龄）、植入部位（肾囊下）、植入后10个月检测 阅读提示：Methods 2.3节 |
| 猪体内植入 | 猪品系、年龄（9-12周龄）、胸腺切除方式、奈拉滨剂量（按体表面积）、给药方案（连续5天）、植入部位（股四头肌）、评估时间点（3-4个月活检，7个月组织学） 阅读提示：Methods 2.4节 |
| 免疫评估 | 流式细胞术抗体组合、初始T细胞定义（大鼠CD3+ CD45RC+ CD62L+；猪CD3+ CD45RA+ CD62L+）、sjTREC检测方法 阅读提示：Methods 2.3, 2.5节 |