构建Tet2条件敲除小鼠肝纤维化模型
评价髓系特异性Tet2缺失对CCl4诱导肝纤维化的影响
对Tet2ΔSys、Tet2ΔAlb和Tet2ΔMye小鼠及其野生型同窝对照腹腔注射CCl4或橄榄油，并评估肝纤维化指标。
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Tet2缺失诱导的单核细胞来源巨噬细胞扩张促进肝纤维化
Tet2 deficiency-induced expansion of monocyte-derived macrophages promotes liver fibrosis
实验完整度
高包含多种基因敲除小鼠模型、骨髓嵌合模型、细胞共培养、mRNA稳定性及RIP-qPCR等多项功能与机制验证。
主要模型
CCl4诱导的Tet2髓系特异性敲除小鼠肝纤维化模型 CD45.1骨髓嵌合小鼠肝纤维化模型 老龄Tet2嵌合小鼠肝纤维化模型 MDMs与HSCs共培养体系
重点核对
CCl4处理剂量（5 μl/g，20% CCl4橄榄油溶液，每周两次，7-8周） TET2ΔMye小鼠Ccl2/Ccl8表达增加 Bindarit给药方案（50 mg/kg，灌胃，每周一次，共7次） IL-6中和抗体剂量（200 μg/只，每两天一次，共8次） pMDMs定义为CD45.2+CD11b+F4/80+Ly6chigh
摘要
由髓系细胞Tet2缺失（TetΔMye）驱动的克隆性造血在老年人中普遍存在；然而，Tet2ΔMye在肝纤维化发病机制中的作用仍不明确。在本研究中，我们证明了Tet2缺陷的单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）通过5hmC介导的RNA-蛋白质相互作用改变，稳定其mRNA，从而促进细胞扩张并升高C-C基序趋化因子配体2/8（Ccl2/8）的分泌。这些趋化因子与Tet2−/−单核细胞上调的C-C基序趋化因子受体（Ccr2/3）结合，形成正反馈回路，放大肝脏中促炎性MDMs（pMDMs）的积聚。Tet2−/− pMDMs通过IL-6激活肝星状细胞，驱动细胞外基质沉积和纤维化进展。用Bindarit药理学抑制Ccl2/Ccl8可减轻MDMs积聚和肝纤维化，而Bindarit与IL-6中和联合治疗在Tet2ΔMye小鼠和模拟Tet2ΔMye相关髓系造血的老龄嵌合模型中协同抑制肝纤维化。这些发现揭示了Tet2ΔMye加重肝纤维化的机制，并强调MDMs清除联合IL-6中和作为Tet2ΔMye相关髓系造血患者肝纤维化的有前景的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Tet2ΔMye驱动的髓系细胞偏斜是否在慢性肝损伤期间加剧纤维化进展？
- 核心机制
- Tet2缺失通过5hmC修饰增强Ccl2和Ccl8 mRNA稳定性，上调pMDMs分泌Ccl2/Ccl8，与单核细胞上Ccr2/Ccr3结合形成正反馈，促进pMDMs肝内积聚；pMDMs分泌IL-6激活HSCs，驱动纤维化。
- 主要证据
- 通过CCl4诱导肝纤维化模型、骨髓嵌合小鼠、MDMs清除、Bindarit抑制Ccl2/Ccl8、抗Ccr2/3阻断、共培养和mRNA稳定性实验，证明Tet2ΔMye通过Ccl2/Ccl8-pMDMs-IL-6-HSCs轴加重纤维化。
- 研究意义
- 强调清除MDMs联合IL-6中和作为Tet2ΔMye相关髓系造血患者肝纤维化的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立竞争性骨髓嵌合小鼠模型
验证Tet2−/−髓系细胞是否足以加重肝纤维化
将CD45.2+Tet2−/−或Tet2+/+ CD11b+细胞移植到致死辐照的CD45.1受体小鼠，随后CCl4处理诱导纤维化。
MDMs清除实验
确定pMDMs在Tet2ΔMye肝纤维化进展中的作用
对Tet2ΔMye肝纤维化小鼠注射Clodronate脂质体或PBS脂质体，评估纤维化指标变化。
利用Bindarit抑制Ccl2/Ccl8
验证Ccl2/Ccl8对pMDMs积聚和纤维化的关键作用
对Tet2ΔMye肝纤维化小鼠口服Bindarit，检测Ccl2/Ccl8水平及纤维化指标。
阻断Ccr2/Ccr3
评估Ccr2/Ccr3信号在单核细胞募集和pMDMs积聚中的作用
给Tet2ΔMye肝纤维化小鼠注射抗Ccr2/Ccr3抗体，检测pMDMs频率及纤维化指标。
mRNA稳定性检测
揭示Tet2缺失稳定Ccl2/Ccl8 mRNA的分子机制
比较Tet2+/+和Tet2−/− pMDMs中Ccl2/Ccl8 mRNA降解速率。
RNA免疫沉淀-qPCR
验证Tet2缺失对RNA结合蛋白与Ccl2/Ccl8 mRNA结合的影响
在Tet2+/+和Tet2−/− pMDMs中进行RIP-qPCR检测Ybx1、Elavl1和Zfp36与Ccl2/Ccl8 mRNA的结合。
MDMs与HSCs共培养
验证pMDMs通过IL-6激活HSCs
将Tet2+/+或Tet2−/− pMDMs与HSCs在Transwell中共培养，检测HSCs激活标志物。
体内联合治疗
探索联合抑制Ccl2/Ccl8和IL-6的协同抗纤维化效果
对Tet2ΔMye纤维化模型小鼠分别给予Bindarit、抗IL-6抗体或两者联合，评估纤维化指标。
老龄BMT模型验证
验证Tet2ΔMye在老龄宿主中是否加速纤维化
将Tet2缺失的骨髓细胞移植到青年和老龄受体，CCl4或BDL诱导纤维化，并联合治疗。
患者样本WES分析
评估TET2突变CHIP与肝纤维化严重程度及Ccl2/Ccl8水平的相关性
对14例肝纤维化患者外周血样本进行全外显子测序，分析CHIP驱动基因突变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Bindarit | MedChemExpress | AF283 |
| 流式分析 | 抗小鼠Ccr2抗体（体内） | Bio-X-cell | BE0457 |
| 抗小鼠Ccr3抗体（体内） | Bio-X-cell | BE0316 | |
| 药物处理 | 抗小鼠IL-6抗体（体内） | Bio-X-cell | BE0046 |
| 抗小鼠IL-1β抗体（体内） | Bio-X-cell | BE0246 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Hycone | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| Percoll分离液 | -- | -- | |
| Transwell小室 | Corning | -- | |
| 基因编辑 | lentiCRISPR v2载体 | -- | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 基因分型 | EasyTaq酶 | Vazyme | -- |
| 细胞增殖 | CFSE染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| ELISA | Col IV ELISA试剂盒 | Ruixin Biotechnology | 20024 |
| HA ELISA试剂盒 | Ruixin Biotechnology | 20067 | |
| Ccl8 ELISA试剂盒 | Ruixin Biotechnology | RX27820 | |
| Ccl2 ELISA试剂盒 | Fantia | MG9180 | |
| TNFα ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10002 | |
| IL-2 ELISA试剂盒 | Bangjing | BGM4904 | |
| IL-1α ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10098 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10003 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10091 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| Collagen I抗体 | Absin | 131984 | |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| Ybx1抗体 | Proteintech | 20339-1-AP | |
| Zfp36抗体 | Proteintech | 12737-1-AP | |
| Elavl1抗体 | Proteintech | 11910-1-AP | |
| Lamin B抗体 | Proteintech | 66095-1 | |
| RT-qPCR | Prime Script RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047Q |
| SYBR Green染料 | Roche | -- | |
| ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 流式分析 | LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FACS Melody流式分选仪 | BD | -- | |
| BD Fortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| RNA测序 | Trizol试剂 | Invitrogen Life Technologies | 15596026 |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TruSeq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| AMPure XP磁珠纯化系统 | Beckman Coulter | -- | |
| NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 全外显子测序 | VAHTS Universal Plus DNA文库制备试剂盒（Illumina V2） | Vazyme | ND627 |
| 肝脏功能检测 | 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Leidu | S03030 |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Leidu | S03040 | |
| 免疫组化/免疫荧光 | 抗F4/80抗体 | Proteintech | 29414-1-AP |
| 抗Ccl8抗体 | Proteintech | 20049-1-AP | |
| 免疫组化 | 抗Ccl2抗体 | Proteintech | 26161-1-AP |
| 免疫组化/免疫荧光 | 抗CD45.1抗体 | Proteintech | 84325-2-RR |
| 免疫荧光 | 抗CD45.2抗体 | Proteintech | 60287-1-Ig |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | ab300421 | |
| 抗Ly6c抗体 | Proteintech | 65296-1-Ig | |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab53444 | |
| 抗CD206抗体 | Abcam | ab300621 | |
| 抗Inos抗体 | Proteintech | 22226-1-AP | |
| 抗NLRP3抗体 | Proteintech | 22226-1-AP | |
| DAPI染料 | Abcam | ab104139 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肝纤维化模型构建 | 小鼠品系、年龄、性别、CCl4剂量与给药频率、持续时间 阅读提示：Materials and methods: Mouse model and treatments; Figure S1A |
| 竞争性骨髓移植模型 | CD45.1受体小鼠、辐照剂量、移植细胞类型与数量、CCl4处理时机 阅读提示：Materials and methods: Myeloid cell isolation and transplantation; Figure 2A |
| MDMs清除实验 | Clodronate脂质体剂量、给药途径、频率、持续时间 阅读提示：Materials and methods: In vivo inhibitors treatment; Figure S2I |
| Bindarit治疗 | Bindarit剂量、给药方式、频率、持续时间 阅读提示：Materials and methods: In vivo inhibitors treatment; Figure S3G |
| Ccr2/Ccr3阻断 | 抗Ccr2/Ccr3抗体剂量、给药频率、持续时间 阅读提示：Materials and methods: In vivo inhibitors treatment; Figure 6C |
| IL-6中和 | 抗IL-6抗体剂量、给药频率、持续时间 阅读提示：Materials and methods: In vivo inhibitors treatment; Figure 8H |
| mRNA稳定性检测 | 放线菌素D浓度、检测时间点、细胞类型 阅读提示：Materials and methods: Tet2 catalytic-dependent regulation of Ccl2 and Ccl8 mRNA stability; Figure 7A-B |
| RIP-qPCR | 抗体种类、交联条件、裂解缓冲液、洗涤条件 阅读提示：Materials and methods: RIP-qPCR; Figure 7D |
| MDMs与HSCs共培养 | 细胞数量、Transwell孔径、共培养时间 阅读提示：Materials and methods: Co-culture of MDMs and HSCs; Figure 8C |
| 老龄BMT模型 | 骨髓细胞比例、受体年龄、辐照剂量、CCl4处理时间 阅读提示：Materials and methods: Construction of chimeric-aged mice mimicking Tet2−/−-related clonal hematopoiesis; Figure 9A |
| 人体样本分析 | 患者纳入标准、样本类型、测序平台、变异检测阈值 阅读提示：Materials and methods: WES sequencing and data analysis; Figure 10A |