制备细菌膜蛋白提取物
获取链杆菌属各物种的膜蛋白作为抗原,用于偶联到荧光微球上。
培养各链杆菌属物种和非靶标菌(A. sobria、A. hydrophila、B. thuringiensis serovar Israelensis),离心收集菌体,裂解并透析获得膜蛋白提取物。
Multiplex serology for Streptobacillus moniliformis and other 'rat bite fever-like' microorganisms for seroprevalence studies in rodents
研究涵盖体外抗原耦联、小鼠和大鼠实验性接种验证、qPCR对照检测以及野生啮齿动物大规模血清学调查,包含多层级实验证据和验证。
CD1小鼠和BALB/c小鼠 WISTAR大鼠 野生和圈养褐家鼠 野生和圈养黑家鼠
实验性接种的CD1和BALB/c小鼠、WISTAR大鼠用于阳性血清生成;每菌株5只小鼠和4只大鼠 口服和鼻内接种剂量:小鼠100μl和10μl,大鼠200μl和50μl;腹腔加强免疫剂量:小鼠100μl,大鼠200μl 血清样品稀释度:小鼠和大鼠血清1:250预孵育,最终1:500;野生啮齿动物渗出液1:50预孵育,最终1:100 临界值由阴性样本集均值加3倍标准差计算(小鼠S. moniliformis: 172;大鼠S. moniliformis: 686) qPCR检测:16S rRNA和gyrB基因靶标,ct值低于36.5判定为阳性
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取链杆菌属各物种的膜蛋白作为抗原,用于偶联到荧光微球上。
培养各链杆菌属物种和非靶标菌(A. sobria、A. hydrophila、B. thuringiensis serovar Israelensis),离心收集菌体,裂解并透析获得膜蛋白提取物。
将不同物种的膜蛋白分别偶联到具有不同荧光特性的微球上,实现多重检测。
将膜蛋白提取物通过碳二亚胺法偶联到MagPlex微球上,封闭后储存。
评估多重血清学的敏感性,并获得针对各链杆菌属物种的阳性对照血清。
CD1和BALB/c小鼠(每菌株5只)经口和鼻内接种两次,随后两次腹腔加强免疫,末次免疫后4周采集血清。
评估与鼠类相关的链杆菌属物种(S. moniliformis、S. notomytis、S. ratti)在大鼠中的血清转换和感染动态,并检测口腔脱落的核酸。
WISTAR大鼠(每菌株4只)经口和鼻内接种两次,随后腹腔加强免疫(S. ratti组两次),定期采集口腔拭子和血液,并进行qPCR和血清学检测。
应用新开发的多重血清学检测野生和圈养大鼠及小鼠中链杆菌属抗体的流行情况。
收集德国各地野生和圈养大鼠及小鼠的胸腔渗出液,通过多重血清学检测S. moniliformis和S. notomytis抗体。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 标准I营养肉汤 | Merck | -- |
| 胰酪大豆肉汤 | Millipore | -- | |
| 细菌裂解 | 辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷 | Sigma-Aldrich | -- |
| 透析 | Slide-A-Lyzer透析卡10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 66810 |
| 蛋白偶联 | MagPlex微球 | Luminex | -- |
| 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| N-羟基琥珀酰亚胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 多重血清学 | 生物素化AffiniPure山羊抗小鼠IgM+IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-065-044 |
| 生物素化AffiniPure山羊抗大鼠IgM+IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-065-068 | |
| 链霉亲和素-R-藻红蛋白 | MOSS Inc. | -- | |
| AffiniPure驴抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-005-150 | |
| qPCR | QuantiTect探针预混液试剂盒 | Qiagen | -- |
| 动物饲养 | 小鼠和大鼠维持饲料No. 3437 | KLIBA NAFAG | -- |
| Wofasteril消毒剂 | Kesla Hygiene AG | -- | |
| qPCR | Kylt RNA/DNA纯化HTP试剂盒 | SAN Group Biotech Germany GmbH | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 实验性接种小鼠 | 小鼠品系(CD1用于S. moniliformis, S. notomytis, S. ratti;BALB/c用于S. felis, S. canis, P. hongkongensis)、每菌株5只、接种途径和剂量(口服100μl、鼻内10μl、腹腔100μl)、时间间隔(初次后4-5周再次口鼻接种,再4周后首次腹腔,再4周后第二次腹腔,末次后4周采血) 阅读提示:Materials and methods: Inoculation of laboratory mice and rats; Fig 1A |
| 实验性接种大鼠 | WISTAR大鼠每菌株4只、接种途径和剂量(口服200μl、鼻内50μl、腹腔200μl)、时间间隔(初次后4周第二次口鼻接种,再4周后腹腔加强,S. ratti组额外一次腹腔加强)、血清采集时间点(0,4,8,12周) 阅读提示:Materials and methods: Inoculation of laboratory mice and rats; Fig 1B |
| 多重血清学检测 | 血清和渗出液的稀释度、预孵育时间、样本混合比例、最终稀释度、临界值计算(均值+3SD) 阅读提示:Materials and methods: Streptobacillus multiplex serology; Table 1 |
| 野生啮齿动物样本采集 | 样本类型(胸腔渗出液)、采集方法(PBS冲洗胸腔)、样本量(褐家鼠107、黑家鼠81、家鼠110) 阅读提示:Materials and methods: Collection of serum and transudate samples |