用于啮齿动物血清流行率研究的 Streptobacillus moniliformis 及其他“类鼠咬热”微生物的多重血清学检测

Multiplex serology for Streptobacillus moniliformis and other 'rat bite fever-like' microorganisms for seroprevalence studies in rodents

作者信息Katja Schmidt, Julia Butt, Ulrich Matt, Klaus Vogel, Calvin Mehl, Rainer G Ulrich, Tobias Eisenberg
PMID41091685
期刊PLoS One
发布时间2025-10-15
DOI10.1371/journal.pone.0333888

实验完整度

研究涵盖体外抗原耦联、小鼠和大鼠实验性接种验证、qPCR对照检测以及野生啮齿动物大规模血清学调查,包含多层级实验证据和验证。

主要模型

CD1小鼠和BALB/c小鼠 WISTAR大鼠 野生和圈养褐家鼠 野生和圈养黑家鼠

重点核对

实验性接种的CD1和BALB/c小鼠、WISTAR大鼠用于阳性血清生成;每菌株5只小鼠和4只大鼠 口服和鼻内接种剂量:小鼠100μl和10μl,大鼠200μl和50μl;腹腔加强免疫剂量:小鼠100μl,大鼠200μl 血清样品稀释度:小鼠和大鼠血清1:250预孵育,最终1:500;野生啮齿动物渗出液1:50预孵育,最终1:100 临界值由阴性样本集均值加3倍标准差计算(小鼠S. moniliformis: 172;大鼠S. moniliformis: 686) qPCR检测:16S rRNA和gyrB基因靶标,ct值低于36.5判定为阳性

摘要

鼠咬热(RBF)是一种主要由念珠状链杆菌(S. moniliformis)引起的人畜共患疾病。挪威鼠或褐鼠(Rattus norvegicus)是 S. moniliformis 的自然宿主,其在鼻咽部携带该细菌而无临床症状。向人类的传播通常通过鼠咬或抓伤发生,但也可通过接触受感染大鼠的排泄物传播。尽管人类 S. moniliformis 感染在世界范围内发生,但很少被诊断。几十年来,S. moniliformis 一直是链杆菌属唯一的已知成员。然而,近年来又鉴定出四个新种,其中两个是能够引起人类与 RBF 相同症状的人畜共患病原体。本研究旨在开发一种覆盖所有已知链杆菌属物种的血清学检测方法。一种基于微球的 S. moniliformis 检测多重荧光免疫测定法已多年用于实验室啮齿动物的常规诊断。在此,该测定法经过调整,能够检测针对所有目前已知链杆菌属物种的抗体,并使用实验性接种的小鼠和大鼠血清以及实验室啮齿动物的阴性血清进行了测试。利用该测定法,我们广泛调查了野生啮齿动物中链杆菌属反应性抗体的流行情况。共检测了来自德国不同饲养场和野生动物种群的 107 只挪威鼠、81 只黑鼠(Rattus rattus)和 110 只家鼠(Mus musculus)的渗出液。在 R. norvegicus 中抗体阳性率为 41%,在 R. rattus 中为 83%,表明链杆菌属在德国的野生和圈养大鼠中广泛存在,而野生小鼠似乎未感染。由于其高通量能力和多重检测格式,链杆菌属多重血清学非常适合用于啮齿动物的大规模血清流行率研究,并有可能在适应后用于人类,从而评估链杆菌属感染风险和 RBF 风险。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
开发一种能够检测所有已知链杆菌属物种抗体的血清学检测方法,并调查德国野生和圈养啮齿动物中链杆菌属感染的血清流行率。
核心机制
链杆菌属物种之间因遗传关系密切导致抗原交叉反应,使得多重血清学无法明确区分感染菌种,但可根据宿主-病原体关联推断大鼠相关的链杆菌属物种。
主要证据
通过实验性接种小鼠和大鼠验证了检测方法的敏感性,所有接种动物均血清阳性;qPCR检测显示口腔拭子阳性不一致,而血清学检测敏感性更高。对野生啮齿动物的检测显示褐家鼠S. moniliformis抗体阳性率41%,黑家鼠S. notomytis抗体阳性率83%,而野生家鼠均为阴性。
研究意义
提供了一种高通量的多重血清学检测工具,可用于啮齿动物和人类的大规模血清流行率研究,有助于评估链杆菌属感染风险和鼠咬热风险。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

制备细菌膜蛋白提取物

获取链杆菌属各物种的膜蛋白作为抗原,用于偶联到荧光微球上。

培养各链杆菌属物种和非靶标菌(A. sobria、A. hydrophila、B. thuringiensis serovar Israelensis),离心收集菌体,裂解并透析获得膜蛋白提取物。

2

蛋白偶联到微球

将不同物种的膜蛋白分别偶联到具有不同荧光特性的微球上,实现多重检测。

将膜蛋白提取物通过碳二亚胺法偶联到MagPlex微球上,封闭后储存。

3

实验性接种小鼠产生阳性血清

评估多重血清学的敏感性,并获得针对各链杆菌属物种的阳性对照血清。

CD1和BALB/c小鼠(每菌株5只)经口和鼻内接种两次,随后两次腹腔加强免疫,末次免疫后4周采集血清。

4

实验性接种大鼠及感染过程监测

评估与鼠类相关的链杆菌属物种(S. moniliformis、S. notomytis、S. ratti)在大鼠中的血清转换和感染动态,并检测口腔脱落的核酸。

WISTAR大鼠(每菌株4只)经口和鼻内接种两次,随后腹腔加强免疫(S. ratti组两次),定期采集口腔拭子和血液,并进行qPCR和血清学检测。

5

野生啮齿动物血清流行率调查

应用新开发的多重血清学检测野生和圈养大鼠及小鼠中链杆菌属抗体的流行情况。

收集德国各地野生和圈养大鼠及小鼠的胸腔渗出液,通过多重血清学检测S. moniliformis和S. notomytis抗体。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证分子表达变化
验证免疫效应

产品清单

实验环节名称品牌货号
标准I营养肉汤Merck--
胰酪大豆肉汤Millipore--
辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷Sigma-Aldrich--
Slide-A-Lyzer透析卡10K MWCOThermo Fisher Scientific66810
MagPlex微球Luminex--
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺Thermo Fisher Scientific--
N-羟基琥珀酰亚胺Thermo Fisher Scientific--
生物素化AffiniPure山羊抗小鼠IgM+IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-065-044
生物素化AffiniPure山羊抗大鼠IgM+IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories112-065-068
链霉亲和素-R-藻红蛋白MOSS Inc.--
AffiniPure驴抗小鼠IgGJackson ImmunoResearch Laboratories715-005-150
QuantiTect探针预混液试剂盒Qiagen--
小鼠和大鼠维持饲料No. 3437KLIBA NAFAG--
Wofasteril消毒剂Kesla Hygiene AG--
Kylt RNA/DNA纯化HTP试剂盒SAN Group Biotech Germany GmbH--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
实验性接种小鼠
小鼠品系(CD1用于S. moniliformis, S. notomytis, S. ratti;BALB/c用于S. felis, S. canis, P. hongkongensis)、每菌株5只、接种途径和剂量(口服100μl、鼻内10μl、腹腔100μl)、时间间隔(初次后4-5周再次口鼻接种,再4周后首次腹腔,再4周后第二次腹腔,末次后4周采血)
阅读提示:Materials and methods: Inoculation of laboratory mice and rats; Fig 1A
实验性接种大鼠
WISTAR大鼠每菌株4只、接种途径和剂量(口服200μl、鼻内50μl、腹腔200μl)、时间间隔(初次后4周第二次口鼻接种,再4周后腹腔加强,S. ratti组额外一次腹腔加强)、血清采集时间点(0,4,8,12周)
阅读提示:Materials and methods: Inoculation of laboratory mice and rats; Fig 1B
多重血清学检测
血清和渗出液的稀释度、预孵育时间、样本混合比例、最终稀释度、临界值计算(均值+3SD)
阅读提示:Materials and methods: Streptobacillus multiplex serology; Table 1
野生啮齿动物样本采集
样本类型(胸腔渗出液)、采集方法(PBS冲洗胸腔)、样本量(褐家鼠107、黑家鼠81、家鼠110)
阅读提示:Materials and methods: Collection of serum and transudate samples