边界DNA片段的选择与转座子介导的插入
验证2-kb边界相关DNA片段是否能在基因组多个位点产生新接触结构域
从K562和hESC共享的边界中选取包含CTCF结合位点和PARL基因TSS的2-kb片段，通过Sleeping Beauty转座子系统插入HAP1细胞，筛选出16个插入位点。
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通过接触结构域边界插入改变基因组折叠
Alteration of genome folding via contact domain boundary insertion
实验完整度
高包含体外细胞系模型、Hi-C等结构分析、CRISPR功能验证及进化分析等多层级实验。
主要模型
HAP1细胞系 小鼠G1E-ER4红细胞系
重点核对
插入片段来源：组织不变的2-kb边界DNA，含CTCF结合位点（CBS）和PARL基因TSS 插入位点：通过Sleeping Beauty转座子随机插入，得到16个位点，分布11条染色体 CTCF和TSS功能验证：通过CRISPR/Cas9删除CBS或TSS或两者，评估对结构域形成的影响 染色质构象检测：使用原位Hi-C和Capture-C，以20-kb分辨率分析接触结构域变化
摘要
动物染色体被划分为接触结构域。致病性的结构域破坏可能由染色体重排或结构因子扰动引起。然而，这种广泛的变化不足以定义结构域形成的最低要求。此外，结构域在多大程度上可以被工程化才刚刚开始探索。为了尝试创建接触结构域，我们将一个组织不变的边界相关的2-kb DNA序列——包含一个CTCF结合位点（CBS）和一个转录起始位点（TSS）——插入到11条染色体上的16个异位位点，并表征了其结构影响。取决于局部限制，该片段可变地形成新结构域、分割已有结构域、改变区室化，并启动反映染色质环挤出的接触。在插入序列中单独或组合删除CBS或TSS揭示了它们对基因组折叠的独特贡献。总之，短DNA插入可能足以塑造空间基因组，其方式受染色质环境影响。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 短DNA序列元件是否足以在基因组中形成新的接触结构域，以及CTCF结合位点和转录起始位点在其中分别发挥什么作用？
- 核心机制
- CTCF结合位点通过与远端收敛的CBS形成相互作用来分隔边界，而转录起始位点通过转录延伸的方向性偏向驱动近端染色质折叠。
- 主要证据
- 将2-kb边界片段插入HAP1细胞多个位点，通过Hi-C观察到新接触结构域形成；CRISPR删除CBS或TSS揭示它们的不同贡献；进化分析显示SINE B2转座子插入与TSS密度相关。
- 研究意义
- 证明了短DNA插入可用于工程化三维基因组，并为理解序列和染色质环境如何共同影响基因组架构提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Hi-C检测插入对染色质结构的影响
检测插入事件是否形成新的接触结构域或改变已有结构域
对包含插入片段的克隆（C21和C25）及WT细胞进行原位Hi-C，分析接触图谱、绝缘分数、区室变化。
CRISPR介导的CBS和TSS功能剖析
确定插入片段中CBS和TSS各自对新结构域形成的作用
在形成新结构域的C21S4和C21S2位点，通过CRISPR/Cas9删除CBS或TSS或两者，结合Hi-C和Capture-C分析结构域变化。
转录和表观特征分析
评估插入对基因表达和表观修饰的影响
对插入克隆进行RNA-seq、H3K27ac、CTCF和RAD21 ChIP-seq，分析转录变化和染色质状态。
进化相关分析
探索转座子插入在进化中可能对新结构域的贡献
利用小鼠G1E-ER4细胞的CTCF ChIP-seq和Hi-C数据，分析SINE B2插入与边界形成的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞分选 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher | -- |
| MACS缓冲液 | -- | -- | |
| 转座子编辑 | pSA-MCS-2kb质粒 | -- | -- |
| pCMV(CAT)T7-SB100质粒 | Addgene | 34879 | |
| pmaxGFP质粒 | Lonza | -- | |
| Nucleofector L试剂盒 | Lonza | -- | |
| 插入位点定位 | PureLink基因组DNA小提试剂盒 | Thermo Fisher | K182001 |
| NEBNext Ultra | NEB | -- | |
| NEBNext多重寡核苷酸（Illumina） | NEB | -- | |
| NEBNext Q5热启动HiFi PCR预混液 | NEB | -- | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1 | Thermo Fisher | 65001 | |
| SeqCap EZ杂交和洗涤试剂盒 | Roche NimbleGen | 05634261001 | |
| Hi-C | DpnII限制酶 | NEB | R0543M |
| DNA聚合酶I大片段（Klenow） | NEB | M0210 | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | -- | |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 核糖核酸酶 | -- | -- | |
| QSonica Q800R3超声仪 | QSonica | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | -- | |
| KAPA文库定量试剂盒 | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| ChIP | H3K27ac抗体 | Active Motif | 39685 |
| CTCF抗体 | Millipore | 07-729 | |
| Rad21抗体 | abcam | ab992 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Thermo Fisher | -- | |
| 小鼠IgG | Sigma | I8140 | |
| 兔IgG | Sigma | I8765 | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28106 | |
| TruSeq ChIP样品制备试剂盒 | Illumina | IP-202-1012 | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23318 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| ScriptSeqv2完整试剂盒 | Illumina | BHMR1224 | |
| TruSeq链特异性总RNA | Illumina | 20020598 | |
| RT-qPCR | iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | -- |
| Power SYBR Green | Thermo Fisher | -- | |
| CRISPR编辑 | pX330质粒 | Addgene | 42230 |
| spCas9蛋白 | Synthego | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HAP1细胞系，IMDM培养基，10% FBS，1%青霉素/链霉素，37°C，5% CO2 阅读提示：Methods - HAP1 cell culture and maintenance |
| 转座子插入 | 使用Sleeping Beauty转座子系统，共转染pSA-MCS-2kb和pCMV(CAT)T7-SB100，电穿孔法，24小时后分选GFP阳性单细胞 阅读提示：Methods - Sleeping Beauty transposon genome editing |
| 插入位点定位 | 使用生物素化寡核苷酸捕获，链霉亲和素磁珠富集，二代测序，PCR验证 阅读提示：Methods - Insertion site mapping and validation |
| Hi-C实验 | 约1千万HAP1细胞，2%甲醛交联10分钟，DpnII酶切，生物素标记，连接，DNA纯化，超声打断至200-300bp，链霉亲和素捕获，建库，双端测序2×75bp 阅读提示：Methods - In situ Hi-C |
| Capture-C实验 | 约1千万HAP1细胞，1%甲醛交联，DpnII酶切，连接，纯化，捕获寡核苷酸富集，测序 阅读提示：Methods - Capture-C |
| ChIP实验 | 约2千万HAP1细胞，1%甲醛交联，超声破碎，抗体：H3K27ac、CTCF、RAD21，免疫沉淀，DNA纯化，建库测序 阅读提示：Methods - ChIP |
| RNA-seq实验 | HAP1细胞，TRIzol提取RNA，RNeasy纯化，建库（ScriptSeq v2或TruSeq Stranded Total RNA），双端测序 阅读提示：Methods - RNA-seq |
| CRISPR编辑 | 使用CRISPR/Cas9或RNP，靶向CBS或TSS，单细胞克隆筛选，基因型鉴定 阅读提示：Methods - CRISPR genome editing |