重组 PvEBP-RII 蛋白表达与纯化
获得具有正确构象的可溶性 PvEBP-RII 蛋白，用于结合实验和受体筛选。
在 Expi293 哺乳动物细胞中表达密码子优化的 PvEBP-RII（T443A 突变）并带有大鼠 CD4 结构域 3/4 和 His 标签，通过镍柱亲和和尺寸排阻色谱纯化，SDS-PAGE 验证纯度。
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补体受体1是人红细胞上间日疟原虫红细胞结合蛋白的受体
Complement receptor 1 is the human erythrocyte receptor for Plasmodium vivax erythrocyte binding protein
实验完整度
高包含重组蛋白表达与纯化、AVEXIS 受体筛选、ELISA 验证、红细胞结合及抑制实验等多个独立证据层级，并明确验证了 CR1 及其 LHR-A 结构域与 PvEBP-RII 的相互作用。
主要模型
DARC 阳性和阴性红细胞 网织红细胞和正常红细胞 重组 PvEBP-RII 蛋白 CR1 重组蛋白及 LHR 亚结构域
重点核对
PvEBP-RII 重组蛋白（含大鼠 CD4 结构域 3 和 4 及 His 标签）结合红细胞 红细胞来源 DARC 阳性和阴性个体，网织红细胞富集方法 AVEXIS 筛选使用 754 种人受体胞外域，阳性对照为 OX68 和 Pos sCR1 阻断 PvEBP-RII 结合红细胞（浓度 0-20 µg/mL） ELISA 验证 CR1 LHR-A 亚结构域与 PvEBP-RII 结合
摘要
非洲人对间日疟原虫（P. vivax）感染的抵抗力这一发现使人们得出结论，即间日疟原虫的入侵依赖于间日疟原虫 Duffy 结合蛋白（PvDBP）与红细胞上表达的 Duffy 抗原趋化因子受体（DARC）的相互作用。然而，最近报道的 DARC 阴性非洲人中的间日疟原虫感染提示，该寄生虫可能使用替代入侵途径来感染 DARC 阴性的网织红细胞。为了鉴定使间日疟原虫能够入侵 DARC 阳性和阴性红细胞的寄生虫配体和红细胞受体，我们表达了含有间日疟原虫红细胞结合蛋白（PvEBP）的 Duffy 结合样（DBL）结构域的 II 区（PvEBP-RII），并验证了该 DBL 结构域与 DARC 阳性和阴性红细胞均结合。此外，使用基于亲合力的细胞外相互作用筛选（AVEXIS）在超过 750 种人类细胞表面受体蛋白中鉴定了 PvEBP 的受体，该方法仅鉴定出补体受体 1（CR1，CD35 或 C3b/C4b 受体）为 PvEBP 受体。CR1 是恶性疟原虫网织红细胞结合蛋白同源物 4（PfRh4）的已知受体，存在于网织红细胞和正常红细胞表面，但其表达随红细胞老化而降低。确实，PvEBP-RII 与网织红细胞和正常红细胞的一个亚群结合，这种结合可被加入可溶性 CR1 重组蛋白所阻断，表明 CR1 是 PvEBP 的受体。此外，我们发现 CR1 的长同源重复 A（LHR-A）亚结构域是介导与 PvEBP-RII 相互作用的唯一亚结构域。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 间日疟原虫红细胞结合蛋白（PvEBP）的宿主红细胞受体是什么？该受体是否存在于 DARC 阳性和阴性红细胞上？
- 核心机制
- PvEBP 的 DBL 结构域与红细胞表面的补体受体1（CR1）直接结合，且主要依赖于 CR1 的 LHR-A 亚结构域，该结合不依赖 DARC。
- 主要证据
- AVEXIS 筛选显示 PvEBP-RII 仅与 CR1 特异性结合；ELISA 证实 PvEBP-RII 与 sCR1 及 LHR-A 剂量依赖性结合；红细胞结合抑制实验表明 sCR1 和 LHR-A 可阻断 PvEBP-RII 与红细胞的结合。
- 研究意义
- 该研究揭示了 PvEBP-CR1 相互作用可作为间日疟原虫入侵 DARC 阴性红细胞的替代途径，为开发针对非洲 DARC 阴性人群的间日疟疫苗提供了候选靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
红细胞结合活性验证
检测 PvEBP-RII 是否结合 DARC 阳性和阴性红细胞，以及是否优先结合网织红细胞。
将不同浓度的 PvEBP-RII 与网织红细胞富集的 DARC 阳性或阴性红细胞共孵育，通过流式细胞术检测结合事件，并用抗 His 抗体和噻唑橙染色区分正常红细胞和网织红细胞。
AVEXIS 受体筛选
鉴定与 PvEBP-RII 相互作用的人类细胞表面受体。
将 PvEBP-RII 作为猎物，与固定了 754 种人受体胞外域的链霉亲和素包被板进行筛选，检测阳性相互作用。
ELISA 验证蛋白相互作用
验证 PvEBP-RII 与 CR1 及其亚结构域（LHR-A, -B, -D+）的剂量依赖性结合。
用重组 sCR1 或 LHR 蛋白包被微孔板，加入不同浓度生物素化的 PvEBP-RII，通过链霉亲和素-HRP 检测结合信号。
红细胞结合抑制实验
验证可溶性 CR1 或 LHR 蛋白能否阻断 PvEBP-RII 与红细胞的结合，进一步确认 CR1 作为受体的功能。
将 PvEBP-RII 与不同浓度的 sCR1 或 LHRs 预孵育，然后与红细胞共孵育，通过流式细胞术检测红细胞结合的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白表达 | Expi293 表达系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| pcDNA3.3 载体 | -- | -- | |
| AscI 限制性内切酶 | New England Lab | -- | |
| NotI 限制性内切酶 | New England Lab | -- | |
| T4 DNA 连接酶 | New England Lab | -- | |
| 镍离子螯合 HiTrap 螯合 HP 或 HisTrap excel 柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 200 10/300 GL 柱 | Cytiva | -- | |
| AKTA 纯化系统 | GE Healthcare Life Science | -- | |
| 重组蛋白分析 | NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 蛋白胶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| eStain 蛋白染色系统 | GenScript | -- | |
| AVEXIS 筛选 | 链霉亲和素包被 384 孔筛选板 | Greiner | -- |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Pierce | -- | |
| TMB 显色底物 | Millipore | -- | |
| Tecan Spark 酶标仪 | Tecan | -- | |
| 红细胞结合实验 | 非织造布过滤器 | Zhixing Bio Co. | -- |
| Nycodenz | Axis-Shield PoC | -- | |
| 不完全 RPMI 1640 培养基 | KD Medical Inc. | -- | |
| Alexa Fluor 647 偶联小鼠抗 His 单克隆抗体 | QIAGEN | -- | |
| 噻唑橙 Retic-COUNT 试剂 | Becton Dickinson | -- | |
| MACSQuant 分析仪 10 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 生物素化 | EZ-Link Micro Sulfo-NHS-生物素化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Zeba 旋转脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Pierce 生物素定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | 96 孔微孔板 | Corning | -- |
| 可溶性 CR1 重组蛋白 | R&D Systems | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 1-Step TMB ELISA 底物溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA 终止液 | Invitrogen | -- | |
| GloMax Explorer 多功能酶标仪 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达 | Expi293 细胞培养条件、转染方法、表达时间（72小时）、纯化柱类型（Ni亲和和SEC） 阅读提示：Materials and Methods: Recombinant Protein Expression and Purification |
| 红细胞结合实验 | 红细胞来源（DARC阳性/阴性）、网织红细胞富集方法（Nycodenz梯度）、红细胞浓度（20%血细胞比容）、孵育时间（3小时）和温度（室温）、流式细胞术参数 阅读提示：Materials and Methods: Reticulocyte Enrichment from Buffy Coat, Erythrocyte Binding Assay |
| AVEXIS 筛选 | 人受体蛋白库（754种）、诱饵和猎物浓度（100 fmol/孔）、孵育时间（30分钟、1小时）、洗涤条件、TMB显色时间（20分钟） 阅读提示：Materials and Methods: Human Receptor Interaction Screening |
| ELISA | 包被蛋白浓度（sCR1 1 µg/mL，LHRs 2 µg/mL）、生物素化 PvEBP-RII 浓度、链霉亲和素-HRP稀释度（1:5,000 或 1:10,000）、孵育时间（室温2小时） 阅读提示：Materials and Methods: ELISA to Evaluate Protein–Protein Interactions |
| 结合抑制实验 | sCR1 和 LHRs 浓度（0-20 µg/mL 和 20/40 µg/mL）、预孵育时间（30分钟，室温）、红细胞类型 阅读提示：Materials and Methods: Erythrocyte Binding Assay and Binding Inhibition Assay |