脂质组学分析鉴定感染相关脂质
鉴定伯氏疏螺旋体感染蜱细胞后发生变化的脂质分子。
用伯氏疏螺旋体刺激ISE6细胞1小时和24小时，进行质谱脂质组学分析。
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Croquemort在蜱中引发免疫缺陷通路的激活
Croquemort elicits activation of the immune deficiency pathway in ticks
实验完整度
高研究包含脂质组学、表面等离子体共振、蛋白结构建模、细胞系功能实验、体内RNAi敲低及感染模型等多个独立证据层级，并验证了免疫信号通路与病原体限制的机制。
主要模型
ISE6蜱细胞系 IDE12蜱细胞系 肩板蜱（Ixodes scapularis）若虫 伯氏疏螺旋体感染的小鼠模型
重点核对
Crq与POPG的结合能力（表面等离子体共振，KD=1.8±0.1 nM） Crq的质膜定位（亚细胞分级分离和荧光显微镜） crq基因沉默效率（siRNA敲低，qRT-PCR验证） 伯氏疏螺旋体感染后蜱体内细菌载量（recA表达） IMD和JNK通路激活（Relish裂解和JNK磷酸化）
摘要
免疫缺陷（IMD）通路在细菌感染时指导节肢动物的宿主防御。在甲壳类动物中，肽聚糖识别蛋白感知微生物部分并启动核因子-κB驱动的免疫反应。在非昆虫节肢动物中引发IMD通路的蛋白质仍然难以捉摸。在这里，我们展示了肩板蜱（Ixodes scapularis）的croquemort（Crq）同源物，一种CD36样蛋白，促进蜱IMD通路的激活。Crq表现出质膜定位并结合脂质激动剂1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油。Crq调节IMD和jun N末端激酶信号级联，并限制莱姆病螺旋体伯氏疏螺旋体的获取。此外，crq沉默的若虫表现出摄食受损和蜕皮至成体延迟，这是由于蜕皮类固醇合成缺陷。总的来说，我们建立了昆虫和甲壳类动物之外节肢动物免疫的独特机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在缺乏典型IMD受体组分的蜱中，哪些蛋白质传感器激活IMD通路并参与免疫防御？
- 核心机制
- 蜱的CD36样蛋白Croquemort作为脂质传感器，结合感染来源的脂质POPG，通过TAK1依赖的方式激活IMD和JNK信号通路，进而限制伯氏疏螺旋体的定植。
- 主要证据
- 脂质组学鉴定POPG为刺激物；pull-down和表面等离子体共振证明Crq结合POPG；细胞实验显示Crq和TAK1对Relish裂解和JNK磷酸化必需；体内RNAi敲低crq或jun增加伯氏疏螺旋体载量。
- 研究意义
- 该研究揭示了非昆虫节肢动物（蜱）中新的免疫识别机制，强调了研究非模式生物对理解先天免疫进化的重要性，并为节肢动物媒介-病原体互作提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定POPG结合蛋白
寻找与免疫刺激脂质POPG结合的蜱蛋白。
使用生物素化POPG从蜱细胞裂解液中pull-down相互作用蛋白，并通过质谱鉴定，筛选膜受体候选分子。
验证Crq-POPG结合及定位
验证Crq是否结合POPG及其亚细胞定位。
通过表面等离子体共振检测重组Crq胞外域与POPG的结合亲和力；通过亚细胞分级分离和荧光显微镜观察Crq在蜱细胞中的定位。
体内基因沉默研究Crq功能
研究Crq在蜱摄食、蜕皮和免疫中的作用。
通过显微注射siRNA沉默蜱若虫中crq表达，观察摄食重量、蜕皮时间、蜕皮类固醇合成及伯氏疏螺旋体载量。
细胞实验验证信号通路
确定Crq是否通过TAK1激活IMD和JNK通路。
在IDE12细胞中分别沉默crq和tak1，用POPG刺激后检测Relish裂解和JNK磷酸化水平。
验证免疫基因表达变化
鉴定Crq调节的IMD和JNK通路下游基因。
在crq或 relish 沉默的蜱中检测puckered、ctenidin-1等基因的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | L15C300培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Millipore Sigma | -- | |
| 胰蛋白胨磷酸肉汤 | BD | -- | |
| 牛脂蛋白浓缩物 | MP Biomedicals | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Millipore Sigma | -- |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Ambion | -- |
| RNA干扰 | Silencer siRNA构建试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 核转染 | SF缓冲液 | Lonza Bioscience | -- |
| 显微镜成像 | CellMask绿色质膜染料 | Invitrogen | -- |
| Hoechst核染料 | AAT Bioquest | -- | |
| 蜕皮类固醇定量 | 20-羟基蜕皮酮EIA试剂盒 | Cayman Chemical | -- |
| 蛋白质表达与纯化 | His标签Crq胞外域 | -- | -- |
| 核磁共振光谱 | 二维核磁共振波谱 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad PRISM软件 | GraphPad Software | 9.1.0 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | IDE12和ISE6细胞的培养条件（培养基、血清浓度、温度） 阅读提示：Materials and Methods, Tick Cell Culture |
| 脂质组学分析 | 伯氏疏螺旋体感染复数、刺激时间、样本量（n=4-6） 阅读提示：Results, I. scapularis Crq Binds the Infection-Derived Lipid POPG; Table 1 |
| Pull-down及质谱 | 生物素化POPG浓度、pull-down条件 阅读提示：Results, I. scapularis Crq Binds the Infection-Derived Lipid POPG; Figure 1A |
| 表面等离子体共振 | POPG浓度范围（12.5-200 nM）、重复次数（n=2） 阅读提示：Results, I. scapularis Crq Binds the Infection-Derived Lipid POPG; Figure 1D-E |
| 细胞转染与刺激 | siRNA浓度（1 μg/mL）、转染试剂、刺激物浓度（10 ng/mL POPG）、刺激时间 阅读提示：Materials and Methods, RNA Interference and Tick Experiments; Figure 4B-C |
| 体内RNAi实验 | siRNA剂量（20-40 ng/蜱）、注射后恢复时间、小鼠品系（C3H/HeJ, C57BL/6J）、感染菌株及剂量、感染时间（最多5天） 阅读提示：Materials and Methods, RNA Interference and Tick Experiments; Figure 3A |