临床相关性分析
评估mTORC1活性和B7-H3表达与患者预后及免疫浸润的关系
分析TCGA 34种癌症类型的患者数据，计算mTORC1评分，进行生存分析和免疫亚型分析。
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mTORC1上调B7-H3/CD276以抑制抗肿瘤T细胞并驱动肿瘤免疫逃逸
mTORC1 upregulates B7-H3/CD276 to inhibit antitumor T cells and drive tumor immune evasion
实验完整度
高包含TCGA数据分析、细胞系、小鼠模型、功能验证（shRNA/CRISPR敲低/敲除）、机制验证（体外激酶实验、ChIP-qPCR、泛素化实验）及CITE-seq等多层级证据。
主要模型
Tsc2缺陷105K肾肿瘤细胞（小鼠模型） Tsc2缺陷TTJ肾肿瘤细胞（小鼠模型） Tsc2缺陷621-101血管肌脂瘤细胞 Tsc2 KO小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
重点核对
mTORC1活性通过S6K磷酸化YY2 T336调控B7-H3表达 B7-H3抑制依赖宿主IFN-γ信号通路 B7-H3抑制导致CD38+CD39+CD4+ T细胞浸润增加 MHC-II表达（CIITA）是B7-H3抑制抗肿瘤效应的必要条件 CD4+ T细胞在B7-H3抑制介导的肿瘤生长抑制中起关键作用
摘要
识别免疫检查点分子调控机制及靶向它们在癌症中的治疗效果至关重要。在此，我们展示了在11060例TCGA人类肿瘤中，免疫检查点B7-H3（CD276）的高表达和mTORC1高活性与免疫抑制表型和较差的临床结局相关。我们发现mTORC1通过p70 S6激酶直接磷酸化转录因子YY2上调B7-H3表达。抑制B7-H3通过涉及T细胞活性和IFN-γ反应增强以及肿瘤细胞MHC-II表达增加的免疫介导机制抑制mTORC1过度活跃的肿瘤生长。CITE-seq揭示了在B7-H3缺陷肿瘤中细胞毒性CD38+CD39+CD4+ T细胞显著增加。在泛人类癌症中，高细胞毒性CD38+CD39+CD4+ T细胞基因特征与更好的临床预后相关。这些结果表明，在包括结节性硬化症（TSC）和淋巴管平滑肌瘤病（LAM）在内的许多人类肿瘤中存在的mTORC1过度活跃驱动B7-H3表达，导致细胞毒性CD4+ T细胞受到抑制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mTORC1活性如何调控B7-H3表达及其对肿瘤免疫逃逸的影响
- 核心机制
- mTORC1通过S6K直接磷酸化转录因子YY2（T336），抑制Smurf1介导的泛素化降解，从而稳定YY2并促进CD276转录，上调B7-H3表达；B7-H3抑制肿瘤免疫，其下调增强CD4+ T细胞介导的抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- TCGA数据分析、Tsc2缺陷细胞模型、体外激酶实验、ChIP-qPCR、泛素化实验、B7-H3敲低/敲除肿瘤模型、CITE-seq及体内功能验证。
- 研究意义
- 揭示了mTORC1过度活跃肿瘤中B7-H3上调的机制，并为B7-H3靶向治疗和CD4+ T细胞免疫治疗提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞模型验证B7-H3表达调控
验证mTORC1对B7-H3表达的正向调控作用
在Tsc2缺陷细胞系中检测B7-H3表达，使用mTOR抑制剂（雷帕霉素、Torin1）、siRNA敲低mTORC1组分、过表达激活突变mTORC1。
转录调控机制研究
鉴定mTORC1调控CD276转录的转录因子
通过启动子荧光素酶报告基因、ChIP-qPCR、siRNA敲低验证YY2对CD276转录的调控。
YY2蛋白稳定性调控机制
阐明S6K磷酸化YY2调控其稳定性的分子机制
通过免疫印迹、体外激酶实验、泛素化实验、免疫共沉淀验证S6K磷酸化YY2 T336抑制Smurf1介导的泛素化降解。
体内抗肿瘤效应验证
评估B7-H3抑制对mTORC1过度活跃肿瘤生长的影响及免疫依赖性
在野生型和免疫缺陷小鼠中皮下接种B7-H3敲低/敲除的Tsc2缺陷细胞，监测肿瘤生长和生存期，使用抗体中和或敲除IFNGR1、CIITA等。
肿瘤免疫微环境分析
解析B7-H3抑制对肿瘤浸润免疫细胞组成和功能的影响
使用CyTOF、CITE-seq、流式细胞术、免疫组化检测肿瘤浸润免疫细胞亚群，特别是CD4+ T细胞亚群。
细胞毒性功能验证
验证CD38+CD39+CD4+ T细胞的细胞毒性功能及MHC-II依赖性
分选CD38+CD39+CD25−CD4+ TIL与肿瘤细胞共培养，使用杀伤实验检测肿瘤细胞死亡。
临床相关性验证
评估CD38+CD39+CD4+ T细胞特征在人类癌症中的预后意义
分析TCGA数据中细胞毒性CD4+ T细胞基因特征与患者生存的关系，并在已发表的肾细胞癌单细胞数据中验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ThermoFisher Scientific | 11995073 |
| 胎牛血清 | R&D SYSTEMS | S11150 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | -- | -- |
| Torin1 | -- | -- | |
| PF-4708671 | -- | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher Scientific | 13778150 |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | P0044 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | ThermoFisher Scientific | 34580 | |
| 免疫沉淀 | 抗GFP抗体磁珠 | MBL | D153-11 |
| 体外激酶实验 | 重组p70 S6激酶 | Millipore | 14-486 |
| DYKDDDK-YY2融合蛋白 | Euprotein | EP8149080 | |
| DYKDDDK-eIF4B融合蛋白 | Euprotein | EP8052870 | |
| ChIP-qPCR | 高灵敏度ChIP试剂盒 | Abcam | ab185913 |
| 双荧光素酶实验 | psiCHECK2载体 | Promega | C8021 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E2920 | |
| RNA提取 | RNeasy Plus微量试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| RT-qPCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 4368814 |
| Taqman快速高级预混液 | ThermoFisher Scientific | 4444963 | |
| StepOne Plus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫组化 | B7-H3抗体 | CST | 14058 |
| CD4抗体 | eBioscience | 14-9766-82 | |
| CD8抗体 | eBioscience | 14-0808-82 | |
| pS6 S235/236抗体 | CST | 2211 | |
| pS6 S240/244抗体 | CST | 5364 | |
| p-p70 S6激酶T389抗体 | CST | 9205 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | CST | 114472 | |
| STAT1抗体 | CST | 14994 | |
| CD31抗体 | Abcam | ab182981 | |
| F4/80抗体 | CST | 70076 | |
| 免疫荧光 | MHC-II抗体 | LSBio | LS-C204829 |
| CD38抗体 | Biolegend | 102725 | |
| CD39抗体 | Abcam | Ab227840 | |
| DAPI染料 | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 体内抗体治疗 | 抗B7-H3抗体 | BioxCell | BE0124 |
| 同型对照抗体 | BioxCell | BE0088 | |
| 抗CD4抗体 | BioXCell | BE0003 | |
| 抗CD8抗体 | BioXCell | BE0117 | |
| 同型对照大鼠IgG2b | BioXCell | BE0090 | |
| 同型对照大鼠IgG1 | BioXCell | BE0088 | |
| 细胞分离 | 小鼠肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 |
| 小鼠肿瘤细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-110-187 | |
| LS分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CyTOF | 顺铂 | Fluidigm | 201064 |
| 小鼠FcR阻断试剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Intercalator | Fluidigm | 201103B | |
| Maxpar细胞采集液 | Fluidigm | 201237 | |
| 流式 | 细胞刺激混合物 | eBioscience | 00-4975-93 |
| Zombie NIR活力染料 | BioLegend | 423105 | |
| T细胞培养 | Dynabeads小鼠T细胞活化磁珠CD3/CD28 | GIBCO | 11452D |
| 白细胞介素-2 | BioLegend | 575402 | |
| 杀伤实验 | 干扰素-γ | Miltenyi Biotech | 130-105-774 |
| Incucyte Nuclight快速红色染料 | Sartorius | 4717 | |
| Incucyte Cytotox绿色染料 | Sartorius | 4633 | |
| CITE-seq | 小鼠TotalSeq-A CITE-seq抗体 | Biolegend | 99833 |
| Chromium Next GEM单细胞3'凝胶珠和文库试剂盒 | 10x Genomics | V.3.1 | |
| RNA-seq | KAPA mRNA HyperPrep试剂盒 | Roche | -- |
| NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| Novaseq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| 细胞增殖 | 结晶紫 | Sigma | V5265 |
| shRNA | 非靶向shRNA | Sigma | SHC016V |
| 靶向B7-H3的shRNA | Sigma | TRCN0000246370, | |
| CRISPR | CRISPR/Cas9敲除载体 | Santa Cruz | sc-430440 |
| 对照CRISPR/Cas9质粒 | Santa Cruz | sc-418922 | |
| 杀伤实验 | IncuCyte S3活细胞成像系统 | Sartorius | 4647 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | Tsc2−/− 105K、TTJ、621-101细胞系；MEFs；培养基DMEM、10% FBS、1%青霉素/链霉素 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 药物处理 | 雷帕霉素浓度20 nM，Torin1浓度500 nM，处理时间24小时 阅读提示：Methods: Cell lines; Figure 2 legend |
| siRNA转染 | siRNA浓度12.5 nM，转染试剂Lipofectamine RNAiMAX 阅读提示：Methods: siRNA transfections |
| 体外激酶实验 | 重组S6K 2μg，底物YY2或eIF4B 2μg，ATP 400μM，30°C孵育1小时 阅读提示：Methods: In vitro Kinase assay |
| 泛素化实验 | PF-4708671浓度30μM，MG132浓度20μM处理5小时 阅读提示：Methods: Ubiquitination assay |
| 双荧光素酶实验 | psiCHECK2-Cd276质粒250ng转染24小时，siRNA 6pmol转染 阅读提示：Methods: Dual luciferase Assays |
| 皮下肿瘤模型 | 细胞接种量2.5×10^6，C57BL/6J雄性小鼠，6周龄 阅读提示：Methods: In vivo experiments in mouse tumor models |
| 抗体处理 | 抗B7-H3抗体剂量300μg/只，每3天注射，共8次；Tsc2+/−小鼠7月龄 阅读提示：Methods: In vivo experiments in mouse tumor models; Supplementary Fig. 3m |
| CyTOF | 肿瘤单细胞悬液制备，cisplatin染色，抗体孵育30分钟，甲醛固定 阅读提示：Methods: Mass Cytometry (CyTOF) analysis |
| CITE-seq | 肿瘤消化方案，CD3+ T细胞分选，TotalSeq-A抗体孵育，10x Genomics平台 阅读提示：Methods: Single-cell dissociation and CITE-seq |
| 杀伤实验 | 效应细胞：CD45+CD3+CD4+CD25−CD38+CD39+ TIL；靶细胞：105K；E:T=10:1；IFN-γ预处理10ng/ml 48h 阅读提示：Methods: Cytotoxic T cell killing assay |