用于快速检测曼氏血吸虫的实时和侧向层析重组酶聚合酶扩增方法的开发

背景：准确诊断并及时治疗是预防并发症和减少血吸虫病传播的有效策略。重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种简单、快速、灵敏、特异且资源需求低的等温扩增方法。本研究旨在开发并优化用于检测曼氏血吸虫的实时（RT）和侧向层析（LF）RPA检测方法。方法：针对曼氏血吸虫线粒体小卫星区域，采用全体积（推荐）和半体积（为降低成本）进行重组酶聚合酶扩增反应，并分别使用RT或LF检测系统。特异性评估使用了其他血吸虫物种、与曼氏血吸虫共流行的蠕虫、人类粪便和尿液以及双脐螺宿主的基因组DNA。分析灵敏度通过基因组DNA系列稀释、目标序列合成拷贝和单个虫卵进行评估。同时测试了两种检测方法在人类尿液和粪便样本中检测曼氏血吸虫DNA的能力。通过在不同温度条件下储存反应组分长达3周，评估了RT-RPA试剂的长期稳定性。结果：全体积和半体积的RT-RPA与LF-RPA（分别称为SmMIT-RPA和SmMIT-LF-RPA）结果相似，因此后续所有实验均采用半体积。SmMIT-RPA对曼氏血吸虫具有100%特异性，能够检测单个虫卵，检测限低至1飞克基因组DNA和一个目标合成拷贝。该检测方法能够在含1个虫卵/克的粪便样本和加标浓度为10飞克/微升的尿液中检测到曼氏血吸虫DNA。SmMIT-RPA试剂在19°C下可稳定保存长达3周，在27°C下可稳定保存2周。SmMIT-LF-RPA与Clinostomidae存在交叉反应，检测限为10飞克和一个目标合成拷贝，能够检测单个虫卵及粪便样本中1个虫卵/克。加标尿液样本中的检测限为10皮克/微升。结论：半体积SmMIT-RPA是一种有前景的现场检测方法。它具有特异性、灵敏性、稳健性、对抑制剂的耐受性，反应组分长期稳定，并可实时可视化结果。