构建表达BRBV GP的重组VSV
在较低生物安全水平下研究BRBV GP，并用于开发中和抗体检测工具。
用BRBV GP基因替换VSV eGFP分子克隆中的G基因，拯救出VSV-BRBV，并在Vero-CCL81细胞上验证其感染和复制能力。
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美国密苏里州人类血清中波旁病毒特异性血清中和抗体的检测
Detection of Bourbon Virus-Specific Serum Neutralizing Antibodies in Human Serum in Missouri, USA
实验完整度
高包含病毒构建与表征、小鼠免疫与单克隆抗体制备、两种中和试验开发、人血清队列筛选及FRNT验证等多个独立证据层级。
主要模型
Vero E6细胞 Vero-CCL81细胞 C57BL/6小鼠 2020年圣路易斯地区440份人血清队列
重点核对
人血清样本：440份，来源于2020年4月27日至5月12日Barnes-Jewish Hospital维生素D检测的残余样本 快速中和试验：VSV-BRBV假病毒，200 FFU，人血清1:20和1:60稀释，孵育1小时，感染8小时 BRBV FRNT：BRBV 200 FFU，人血清起始稀释1:40，连续3倍稀释至1:29,160，孵育1小时，感染24小时 阳性对照：5只BRBV感染小鼠22天后的混合血清，IC50范围为1:500至1:1,350 结果判定：快速试验以80%抑制为阳性阈值，FRNT验证阳性样本
摘要
波旁病毒（BRBV）于2014年在首例人类死亡病例中被发现。此后，在美国密苏里州和堪萨斯州的蜱虫（美洲花蜱）中检测到该病毒。尽管BRBV在这些州的蜱虫中流行率很高，但报道的人类病例很少，社区中BRBV的真实感染负担未知。在此，我们开发了两种病毒中和试验，一种水疱性口炎病毒（VSV）-BRBV假病毒快速试验和一种BRBV病灶减少中和试验，以评估2020年在密苏里州圣路易斯市采集的人血清中BRBV中和抗体的血清阳性率。在测试的440份人血清样本中，三份（0.7%）能够强效中和VSV-BRBV和野生型BRBV。这些发现表明，人类感染BRBV比以前认识的更为常见。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类血清中是否存在BRBV特异性中和抗体，以及BRBV在社区中的真实感染负担如何？
- 核心机制
- BRBV GP是病毒中和抗体的主要靶点，通过检测针对GP的中和抗体可评估既往感染。
- 主要证据
- 在440份人血清中，3份（0.7%）在VSV-BRBV快速试验中显示>80%抑制，并在BRBV FRNT中确认能中和活病毒，IC50分别为1:2,631、1:1,259和1:938。
- 研究意义
- 该研究首次报道了人类血清中BRBV中和抗体的血清阳性率，提示BRBV感染比仅基于已报告病例所预期的更为常见。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
制备并表征BRBV GP特异性单克隆抗体
获取BRBV GP特异性抗体，用于检测BRBV感染细胞和开发FRNT。
用灭活BRBV和重组GP免疫C57BL/6小鼠，通过流式分选GP特异性B细胞，克隆VH和VL基因，表达纯化9株人源化单抗，并经ELISA和FFA验证其特异性和检测能力。
开发快速eGFP-based中和试验
高通量筛选人血清中BRBV中和抗体。
用VSV-BRBV感染Vero E6细胞，检测血清对病毒感染（eGFP表达）的抑制，并以无血清对照归一化。
开发BRBV FRNT并验证人血清中和活性
确认快速试验阳性样本对活BRBV的中和能力。
将人血清与BRBV孵育后感染Vero E6细胞，用E02单抗检测病灶，计算中和抑制率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Biowest | -- | |
| 青霉素 | Life Technologies | -- | |
| 链霉素 | Life Technologies | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Corning | -- | |
| Expi293表达培养基 | Gibco | -- | |
| 病毒拯救 | 痘苗病毒vTF7-3 | -- | -- |
| 病毒纯化 | QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 病毒鉴定 | Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒 | Qiagen | -- |
| 病毒测序 | Illumina Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| MiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 重组蛋白表达 | pOET1载体 | Mirus Bio | -- |
| flashBAC杆状病毒表达系统 | Mirus Bio | -- | |
| High Five细胞 | Gibco | -- | |
| 重组蛋白纯化 | Ni2+亲和树脂 | GoldBio | -- |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | -- | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| 重组蛋白表达 | pFM1.2R载体 | -- | -- |
| 动物实验 | Addavax佐剂 | InvivoGen | -- |
| β-丙内酯 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式细胞术 | 抗CD16/CD32抗体 (93) | BioLegend | -- |
| 抗CD19-FITC抗体 (1D3) | BioLegend | -- | |
| 抗IgD-APC-Cy7-A抗体 (11-26c.2a) | BioLegend | -- | |
| 抗Fas-PE-A抗体 (Jo2) | BD Biosciences | -- | |
| 抗GL7-PerCP-Cy5.5-A抗体 (GL7) | BioLegend | -- | |
| 抗CD71-PE-Cy7-A抗体 (RI7217) | BioLegend | -- | |
| 抗CD138-BV421抗体 (281-2) | BioLegend | -- | |
| 抗CD4-AF700抗体 (GK1.5) | BioLegend | -- | |
| Zombie Aqua活力染料 | BioLegend | -- | |
| Brilliant Stain缓冲液 | BD Horizon | -- | |
| 单抗生产 | ExpiFectamine 293表达试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 单抗纯化 | 蛋白A琼脂糖 | Invitrogen | -- |
| ELISA | 山羊抗人IgG-HRP | Jackson ImmunoResearch | 109-035-088 |
| 山羊抗小鼠IgG1-HRP | Southern Biotech | 1070-05 | |
| Synergy HT酶标仪 | BioTek | -- | |
| FFA | 甲基纤维素 | Sigma | -- |
| MEM培养基 | Corning | -- | |
| TMB底物 | Vector Laboratories | -- | |
| ImmunoSpot分析仪 | Cellular Technologies | -- | |
| 快速中和试验 | Hoechst染料 | Sigma | -- |
| InCell 2000分析仪 | GE Healthcare | -- | |
| 中和试验 | E02单克隆抗体 | -- | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒构建与表征 | VSV-BRBV的拯救条件、病毒滴度（>10^8 FFU/mL）、空斑大小 阅读提示：Materials and Methods: Virus and cell culture; Results: 构建VSV-BRBV；图1图注 |
| 单克隆抗体制备 | 小鼠品系（C57BL/6）、周龄（11-12周）、免疫剂量（500ng灭活BRBV，5μg rGP）、免疫间隔（33天）、B细胞分选门控 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments; Flow cytometry; Results: 图2 |
| 快速eGFP-based中和试验 | Vero E6细胞、VSV-BRBV用量（200 FFU）、人血清稀释（1:20和1:60）、孵育时间（1小时）、感染时间（8小时）、阳性对照血清来源与稀释 阅读提示：Materials and Methods: Rapid eGFP-based VSV-BRBV GP virus neutralization assay; Results: 图3 |
| BRBV FRNT | Vero E6细胞、BRBV用量（200 FFU）、人血清起始稀释（1:40）、系列稀释（3倍）、孵育时间（1小时）、感染时间（24小时）、检测抗体（E02 MAb） 阅读提示：Materials and Methods: BRBV neutralization assay; Results: 图4 |
| 人血清队列 | 样本来源（2020年4月27日至5月12日Barnes-Jewish Hospital维生素D检测残余样本）、样本量（440份）、伦理批号 阅读提示：Materials and Methods: Human serum cohort |