培养、下一代测序和免疫分析在糖尿病足溃疡病原体鉴定中的比较研究

Comparative study of culture, next-generation sequencing, and immunoassay for identification of pathogen in diabetic foot ulcer

作者信息Jason Scott Lipof, Courtney Marie Cora Jones, John Daiss, Irvin Oh
PMID33543785
发布时间2021-12
DOI10.1002/jor.25001

实验完整度

前瞻性观察研究,采用培养、NGS和免疫分析三种方法对比,但缺乏功能验证和机制验证,样本量较小。

主要模型

糖尿病患者感染性糖尿病足溃疡(DFU)

重点核对

纳入糖尿病患者(I型或II型)且年龄>18岁,手术清创或截肢后获取骨样本 样本处理:一个样本用于标准培养(需氧、厌氧、真菌),另一个在-80°C保存后送MicroGenDX进行NGS 免疫分析:外周血分离PBMC培养72小时收集MENSA,血清用于Luminex多重免疫分析 统计分析:使用Kappa系数评估一致性,以NGS为金标准

摘要

深层肌肉骨骼感染(MSKI)的治疗始于准确识别致病病原体、手术切除/清创以及一段疗程的基于培养的抗生素治疗。尽管如此,复发性感染的发生率仍在上升。主要原因是初始培养不准确或阴性。准确识别主要病原体对治疗成功至关重要,这对治疗糖尿病足感染(DFI)和保肢努力尤为重要。本研究旨在利用标准培养(SC)、下一代测序(NGS)和新合成的针对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的抗体免疫分析(NSA)进行诊断。这是一项经我们机构审查委员会批准的II级前瞻性观察研究。2018年10月至2019年9月期间,由一名学术骨科医生对因DFI接受手术清创或截肢的18岁以上I型或II型糖尿病患者进行入组。术中从伤口基底部获取样本,送培养、NGS,并在诊断时获取外周血样本。共有30名DFI患者接受干预并入组。NGS和SC对金黄色葡萄球菌(K=0.86)和GBS(K=1.0)高度一致;NSA和培养对金黄色葡萄球菌(K=0.18)和GBS(K=0.67)一致性一般;NGS和NSA对金黄色葡萄球菌(K=0.1667)和GBS(K=0.67)一致性一般。临床意义声明——我们的研究表明,在DFU中培养和NGS之间具有高度一致性。NGS可能作为DFI诊断的有用辅助手段。关键词:下一代测序、免疫分析、MENSA、糖尿病足溃疡。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
在糖尿病足溃疡中,标准培养、NGS和NSA免疫分析在鉴定主要病原体(金黄色葡萄球菌和无乳链球菌)方面的一致性如何?
核心机制
文中未明确说明
主要证据
对30例DFI患者样本进行培养、NGS和免疫分析,结果显示培养和NGS对金黄色葡萄球菌(Kappa=0.86)和GBS(Kappa=1.0)高度一致,而NSA与培养和NGS的一致性一般(Kappa范围0.17-0.67)。
研究意义
研究结果支持NGS可作为培养的辅助手段用于DFI诊断,但免疫分析的临床作用尚需进一步研究。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

患者入组和样本采集

获取DFI患者的骨样本和血液样本,用于后续检测

纳入30例DFI患者,术中从溃疡基底部取两块骨样本,分别用于标准培养和NGS;诊断时采集外周血用于免疫分析。

2

标准培养和NGS分析

比较标准培养和NGS在病原体鉴定上的一致性

对骨样本进行标准培养,另一部分样本经MicroGenDX进行NGS,检测细菌和真菌的16S rRNA和ITS区域。

3

NSA免疫分析

检测针对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的新合成抗体,评估其与培养和NGS的一致性

从全血分离PBMC,培养72小时收集MENSA,血清和MENSA用于Luminex免疫分析。

4

伤口愈合评估

评估患者术后12周伤口愈合情况,并分析其与检测结果的关系

术后12周或二次截肢时评估伤口愈合状态,分为愈合和未愈合组。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Ion Torrent个人基因组机Thermo Fisher Scientific--
Bio-Plex 200系统Bio-Rad--
Ficoll-Paque淋巴细胞分离液----
肝素钠采血管----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
患者入组
纳入标准:I型或II型糖尿病,年龄>18岁;排除标准:静脉淤积性溃疡、严重缺血等
阅读提示:Methods: Study Design and Patients
样本采集和处理
骨样本:两块豌豆大小;血液:两管肝素钠和一管血清管;样本保存温度:-80°C
阅读提示:Methods: Operative Procedures and Specimen Collection and Whole blood processing
标准培养
培养类型:需氧、厌氧、真菌
阅读提示:Methods: Operative Procedures and Specimen Collection
NGS测序
测序平台:Ion Torrent PGM;数据库:NIH GenBank;比对一致性≥90%
阅读提示:Methods: Next-Generation Sequencing
免疫分析
PBMC培养72小时;MENSA和血清1:10000稀释;检测重复次数:双份
阅读提示:Methods: Whole blood processing and Multiplex Luminex Immunoassay
数据分析
Kappa系数计算;以NGS为金标准
阅读提示:Methods: Data and Statistical Analysis