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酶切破坏CD环通过共同的TTR错误折叠通路促进有毒转甲状腺素蛋白寡聚体的形成
Disruption of the CD Loop by Enzymatic Cleavage Promotes the Formation of Toxic Transthyretin Oligomers through a Common Transthyretin Misfolding Pathway
摘要
全长TTR的淀粉样蛋白形成涉及天然四聚体解离为错误折叠的单体，这些单体随后自组装形成淀粉样蛋白。除全长TTR外，体内还观察到包含残基49-127的C端片段，提示存在额外的错误折叠途径。先前研究推测蛋白水解切割可能导致C端片段TTR淀粉样蛋白的形成。本文报道了在有无丝氨酸蛋白酶存在下，TTR变异体（G53A）错误折叠与聚集的机制研究。通过振荡促进G53A在CD环（K48和T49）发生蛋白水解切割，可加速TTR的错误折叠与聚集，表明蛋白水解切割可能导致C端片段（残基49-127）的聚集。为深入探究蛋白水解切割促进TTR错误折叠的机制，我们比较了胰蛋白酶存在与否时G53A TTR的结构变化。综合生物物理分析显示，蛋白水解切割加速了具有细胞毒活性的球形小寡聚体的形成。然而，截短的TTR似乎保持了类天然结构，而非C端片段（残基49-127）从天然状态解离并展开。此外，固态核磁共振与傅里叶变换红外光谱结构研究表明，全长与切割后TTR形成的两种聚集体具有几乎相同的分子结构特征，表明CD环的蛋白水解切割通过破坏天然四聚体稳定性，经由共同的TTR错误折叠与聚集机制（而非独特的分子机制）加速了寡聚体形成。
实验方法
产品清单
| 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|
| HiTrap Q HP层析柱 | GE Healthcare | -- |
| HiLoad 16/60 Superdex 200层析柱 | GE Healthcare | -- |
| 96孔黑色透明底微孔板 | -- | -- |
| 轨道摇床 | -- | -- |
| SpectraMax® 微孔板读数仪 | -- | -- |
| 1毫米石英比色皿 | -- | -- |
| DynaPro Nano Star | -- | -- |
| 4-12%梯度双Tris SDS-PAGE凝胶 | -- | -- |
| 96孔黑色透明底板 | -- | -- |
| Millipore C18 Zip-Tips | Millipore | -- |
| MALDI靶板 | -- | -- |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF质谱仪 | Bruker | Autoflex Speed |
| Formvar/碳膜包被的400目铜网 | -- | -- |
| Philips CM12透射电子显微镜 | Philips | CM12 |
| Jasco J-815圆二色光谱仪 | Jasco | J-815 |
| Nicolet iS50衰减全反射附件 | Nicolet | iS50 |
| Bruker 800 MHz核磁共振谱仪 | Bruker | 800 MHz |
| 3.2毫米魔角旋转探头 | -- | -- |