蛋白表达与纯化
获得重组的G53A TTR蛋白用于后续实验
使用BL21(DE3)表达系统和pMMHa质粒表达重组人G53A TTR，经HiTrap Q HP和Superdex 200纯化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
酶切CD环通过共同的转甲状腺素蛋白错误折叠途径促进毒性转甲状腺素蛋白寡聚体的形成
Disruption of the CD Loop by Enzymatic Cleavage Promotes the Formation of Toxic Transthyretin Oligomers through a Common Transthyretin Misfolding Pathway
实验完整度
高包含体外蛋白表达纯化、ThT荧光、DLS、TEM、CD、FT-IR、固态NMR、MTT细胞毒性试验等多种实验方法，并进行了机制验证。
主要模型
G53A TTR重组蛋白 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系
重点核对
G53A TTR重组蛋白的表达与纯化 胰蛋白酶浓度及酶与底物比例（1:200） 孵育时间（如8小时、1周、2周） 搅拌速度（250 rpm） MTT实验中SH-SY5Y细胞的处理浓度（0.25和0.5 mg/mL）
摘要
全长TTR的淀粉样形成涉及天然四聚体解离为错误折叠的单体，这些单体自组装成淀粉样蛋白。除全长TTR外，在体内还观察到包括残基49-127在内的C末端片段，暗示存在额外的错误折叠途径。先前有人提出蛋白水解切割可能导致C末端片段TTR淀粉样蛋白的形成。在此，我们报告了在有无丝氨酸蛋白酶（trypsin）存在下，TTR变体（G53A）错误折叠和聚集的机制研究。在搅拌条件下，CD环（K48-T49）的蛋白水解切割促进了TTR的错误折叠和聚集，提示蛋白水解切割可能导致C末端片段（残基49-127）的聚集。为了更深入地了解蛋白水解切割促进的TTR错误折叠，我们研究了在有无胰蛋白酶存在下G53A TTR的结构变化。我们结合生物物理分析发现，蛋白水解切割加速了球形小寡聚体的形成，这些寡聚体表现出细胞毒性活性。然而，截短的TTR似乎保持类似天然的结构，而不是C末端片段（49-127）从天然状态释放并展开。此外，我们的固态NMR和FT-IR结构研究表明，全长和切割后的TTR衍生的两种聚集体表现出几乎相同的分子结构特征，表明CD环中的蛋白水解切割使天然四聚体结构不稳定，并通过共同的TTR错误折叠和聚集机制加速寡聚体形成，而非通过不同的分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白水解切割CD环（K48-T49）如何影响TTR的聚集途径？
- 核心机制
- CD环的蛋白水解切割使天然四聚体结构不稳定，加速四聚体解离为单体，通过共同的TTR错误折叠途径促进毒性寡聚体的形成。
- 主要证据
- CD光谱显示切割后结构略有变化但仍保持折叠；DLS和TEM显示切割加速球形寡聚体形成；MTT实验显示这些寡聚体具有细胞毒性；FT-IR和固态NMR显示全长和截短TTR形成的聚集体具有相似的结构。
- 研究意义
- 研究揭示了蛋白水解切割在TTR淀粉样变性中的作用，为理解体内C末端片段的聚集机制提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白水解切割与聚集动力学
验证胰蛋白酶切割K48-T49肽键并促进TTR聚集
将G53A TTR（0.7 mg/mL）与胰蛋白酶（酶底物比1:200）在37°C、250 rpm搅拌下孵育，监测ThT荧光和OD400，并通过SDS-PAGE和质谱检测切割产物。
早期结构变化分析
检测蛋白水解切割是否导致TTR显著去折叠
使用远紫外圆二色谱（CD）监测G53A TTR在有无胰蛋白酶存在下孵育过程中的二级结构变化，并用DICHROWEB软件分析。
寡聚体形成与形态观察
表征蛋白水解切割对寡聚体形成和形态的影响
利用动态光散射（DLS）监测早期寡聚化，透射电镜（TEM）观察寡聚体形态。
细胞毒性评估
测定蛋白水解切割形成的寡聚体对细胞的毒性
使用MTT法检测经胰蛋白酶处理和不处理的G53A TTR寡聚体对SH-SY5Y细胞活力的影响。
聚集体结构比较
比较全长和截短TTR聚集体的分子结构是否一致
收集孵育后的聚集体，通过FT-IR和固态NMR分析二级结构和分子构象。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | pMMHa质粒 | -- | -- |
| BL21(DE3)表达系统 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | HiTrap Q HP柱 | GE Healthcare | -- |
| HiLoad 16/60 Superdex 200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白水解 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| SDS-PAGE | SDS上样缓冲液 | -- | -- |
| Bis-Tris SDS-PAGE凝胶 | -- | -- | |
| MES电泳缓冲液 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| MTT检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| MALDI质谱 | Millipore C18 Zip-Tips | Millipore | -- |
| 芥子酸基质 | -- | -- | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF质谱仪 | Bruker | -- | |
| TEM | Formvar/碳包覆铜网（400目） | -- | -- |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| Philips CM12透射电子显微镜 | Philips | -- | |
| CD光谱 | Jasco J-815圆二色光谱仪 | Jasco | -- |
| FT-IR | Nicolet iS50 ATR红外光谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 固态NMR | Bruker 800 MHz核磁共振谱仪 | Bruker | -- |
| ThT荧光 | 硫黄素T | -- | -- |
| SpectraMax酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| DLS | DynaPro Nano Star动态光散射仪 | Wyatt Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达 | IPTG浓度、表达时间、表达温度 阅读提示：参见材料与方法部分‘Protein expression and purification’ |
| 蛋白水解与聚集 | 酶底物比、搅拌速度、孵育时间 阅读提示：参见材料与方法中‘ThT fluorescence’、‘Aggregation Kinetics’及图2图例 |
| 细胞毒性 | 细胞系、细胞密度、TTR浓度、处理时间 阅读提示：参见材料与方法中‘MTT assay’及图5图例 |
| 结构分析 | 蛋白浓度、孵育时间、NMR参数（DARR混合时间等） 阅读提示：参见材料与方法中‘FT-IR spectroscopy’、‘Solid-state NMR’及图6图例 |