鉴定和分类T. musculis
鉴定小鼠肠道中的共生原生动物并确定其系统发育位置。
从内源小鼠盲肠内容物中筛选出带鞭毛的原生动物，通过扫描电镜（SEM）观察形态，并对ITS和18S rRNA基因进行测序和系统发育分析，鉴定为T. musculis。
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共生细菌以饮食营养依赖性方式影响原生动物整合入小鼠肠道微生物群落
Commensal Bacteria Impact a Protozoan's Integration into the Murine Gut Microbiota in a Dietary Nutrient-Dependent Manner
实验完整度
高包含体外模型（纯培养、显微镜）、体内动物模型（小鼠饮食干预、抗生素处理、细菌回补）及测序分析，且功能验证和机制验证明确。
主要模型
C57BL/6小鼠模型 小鼠肠道微生物群落
重点核对
小鼠来源：C57BL/6雄性，6-8周龄，T. musculis阴性 饮食类型：正常饮食（ND）、高脂饮食（HFD）、高脂饮食+10%菊粉（HFI） T. musculis口服剂量：1×10^6原生动物/只 抗生素处理：氨苄青霉素、万古霉素、新霉素（500、250、500 mg/L饮水） 双歧杆菌口服剂量：1×10^9 CFU/只
摘要
我们目前对肠道宿主-微生物相互作用的理解主要由主要关注原核细菌群落的研究所主导。然而，有一个未被充分认识的真核共生原生生物群落是哺乳动物微生物群落的组成部分。共生原生动物与细菌如何相互作用以形成稳定的微生物群落仍知之甚少。在这里，我们描述了一种鼠类原生生物共生体，在系统发育上被归类为Tritrichomonas musculis，其在肠道中的定植导致野生型C57BL/6小鼠肠道细菌丰度和多样性降低。同时，饮食营养和共生细菌也影响了该原生动物的肠道定植和稳定性。虽然喂食正常饮食的小鼠有大量的T. musculis，但转换为西式高脂饮食导致原生动物从肠道中消失。在高脂饮食中添加菊粉作为膳食纤维部分恢复了原生动物的定植。此外，广谱抗生素混合物即使在低纤维高脂饮食下也允许T. musculis的定居。此外，在高脂饮食中口服长双歧杆菌JDM301并补充膳食菊粉，以双歧杆菌物种依赖性方式影响原生动物的肠道定植。总的来说，我们的研究描述了一个饮食营养依赖的鼠类共生原生动物-细菌串扰作为宿主肠道微生物群落重要调节因子的例子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 共生原生动物如何整合入以细菌为主的肠道微生物群落，以及饮食营养和共生细菌如何影响这一过程？
- 核心机制
- T. musculis与肠道细菌存在竞争和合作两种跨界相互作用；其对膳食纤维的需求与细菌竞争导致高脂低纤维条件下的定植失败，而特定双歧杆菌（如B. longum JDM301）在菊粉存在时支持其定植，B. adolescentis则抑制。
- 主要证据
- 通过小鼠共饲养、口服T. musculis、饮食转换（ND/HFD/HFI）、抗生素处理及双歧杆菌补充，结合16S rRNA测序和显微镜检查，发现T. musculis降低细菌多样性，HFD抑制其定植，菊粉部分恢复，抗生素完全恢复，双歧杆菌种依赖性影响。
- 研究意义
- 该研究揭示了饮食依赖的原生动物-细菌跨界相互作用是塑造肠道微生物群落的重要调节因子，为理解多物种微生物群落形成规则及潜在干预提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测T. musculis对肠道细菌群落的影响
确定T. musculis定植是否改变肠道细菌的丰度和多样性。
将T. musculis阴性小鼠与阳性小鼠共饲养4周，使阴性小鼠获得定植，然后收集盲肠内容物，通过qPCR定量总细菌16S rRNA基因，并利用16S rRNA测序分析菌群结构和多样性。
测试高脂饮食对T. musculis定植的影响
评估西式高脂饮食是否影响T. musculis的定植能力。
将T. musculis阴性小鼠喂食ND，口服T. musculis 1×10^6/只，次日分别切换为ND或HFD，2周后检测盲肠内容物中T. musculis和细菌的变化。
补充菊粉对T. musculis定植的恢复作用
探究高脂饮食中膳食纤维不足是否导致T. musculis消失，并测试补充菊粉能否恢复其定植。
将小鼠喂食HFD或HFI（含10%菊粉），2周后检测T. musculis数量和细菌群落变化。
应用抗生素消除细菌对T. musculis定植的影响
检验肠道细菌是否对T. musculis定植产生竞争性抑制。
在喂食HFD的小鼠中，口服T. musculis后给予广谱抗生素混合物（氨苄青霉素、万古霉素、新霉素）饮水2周，检测T. musculis定植和细菌群落变化。
评估特定双歧杆菌对T. musculis定植的影响
测试在菊粉富集环境中，特定双歧杆菌菌株是否影响T. musculis的定植。
在喂食HFI或ND的小鼠中，口服T. musculis和B. longum JDM301 (1×10^9 CFU)或B. adolescentis，2周后检测T. musculis定植情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 扫描电镜样本制备 | HCP-2临界点干燥仪 | Hitachi | HCP-2 |
| EM ACE600高真空镀膜仪 | Leica | EM | |
| 扫描电镜观察 | Teneo VS扫描电子显微镜 | FEI | Teneo |
| 细菌培养 | MRS培养基 | BD Difco | -- |
| L-半胱氨酸盐酸盐 | -- | -- | |
| 厌氧工作站 | Don Whitley Scientific | -- | |
| qPCR | FastStart通用SYBR Green预混液 | Roche | -- |
| DNA提取 | QIAmp快速粪便DNA微量提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| E.Z.N.A.粪便DNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- | |
| PCR扩增 | FastPfu聚合酶 | -- | -- |
| DNA定量 | Qubit 3.0荧光计 | Life Invitrogen | Qubit |
| 16S rRNA测序 | Illumina HiSeq 2500测序系统 | Illumina | HiSeq |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物与饮食 | 小鼠品系：C57BL/6雄性，6-8周龄，T. musculis阴性；饮食类型：ND、HFD（60%能量来自脂肪）、HFI（含10%菊粉）；处理时间：2周 阅读提示：Materials and Methods - Animals and feeding conditions |
| T. musculis获取与给药 | 口服菌量：1×10^6原生动物/只；纯化方法：Percoll梯度离心；给药时间：实验第0天 阅读提示：Materials and Methods - Purification of T. musculis from cecal content |
| 抗生素处理 | 抗生素混合物：氨苄青霉素500 mg/L、万古霉素250 mg/L、新霉素500 mg/L；给药途径：饮水；持续时间：2周 阅读提示：Materials and Methods - Animals and feeding conditions |
| 细菌回补 | 双歧杆菌菌株：B. longum JDM301（1×10^9 CFU/只）、B. adolescentis ATCC 15703（1×10^9 CFU/只）；给药途径：口服；培养基：MRS-cys 阅读提示：Materials and Methods - Bacterial strains and growth conditions |
| 检测指标 | T. musculis计数：使用血细胞计数器；细菌定量：qPCR 16S rRNA基因；菌群分析：16S rRNA V3-V4区域测序 阅读提示：Materials and Methods - Quantification of T. musculis protozoa in the cecal content; Quantification of bacteria in the cecal content; Bacterial diversity analysis |