通过实时PCR和Sanger测序检测的头颈部鳞状细胞乳头状瘤中HPV基因型的患病率、解剖分布及其意义

The Prevalence, Anatomic Distribution and Significance of HPV Genotypes in Head and Neck Squamous Papillomas as Detected by Real-Time PCR and Sanger Sequencing

作者信息A Trzcinska, W Zhang, M Gitman, W H Westra
PMID31352627
发布时间2020-06
DOI10.1007/s12105-019-01057-7

实验完整度

研究包含回顾性病例分析、HPV检测(实时PCR、Sanger测序)、p16免疫组化验证,但缺乏功能实验和动物模型,证据层级有限。

主要模型

头颈部鳞状细胞乳头状瘤临床样本(129例) 喉部乳头状瘤(含复发性呼吸道乳头状瘤病病例) 口腔及口咽部乳头状瘤

重点核对

HPV检测方法:实时PCR(针对L1区域),基因分型采用Sanger测序 样本来源:2012-2018年西奈山医院手术病理档案 组织样本类型:福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片 高危HPV阳性病例需复核形态学、p16免疫组化及重复PCR检测 复发性呼吸道乳头状瘤(RRP)定义:黏膜连续区域出现多发融合SP和/或同一解剖部位随时间复发

摘要

头颈部鳞状细胞乳头状瘤通常被认为是由人乳头瘤病毒驱动的过程,但报告的HPV检出率差异很大。此外,它们通常被认为是良性病变,但高危型HPV的检出常有报道。考虑到HPV相关头颈部癌症的惊人增加,这一发现尤其令临床医生及其患者不安。HPV检出结果的反复无常在很大程度上反映了方法学的差异。本研究的目的是回顾本机构使用最先进的检测方法来确定头颈部鳞状细胞乳头状瘤中HPV的存在、类型和解剖分布的经验。对西奈山医院2012年至2018年间所有进行过HPV检测的鳞状细胞乳头状瘤的手术病理档案进行了回顾。使用针对低危和高危HPV类型的L1区域的引物,通过实时PCR对组织块进行HPV筛查。对HPV阳性病例进行基因分型。对最初报告为高危HPV阳性的病例重复进行HPV检测。134例进行了HPV分析。在131例有足够细胞材料的病例中,2例因HPV检测结果不确定而被排除。其余129例为本研究的基础。38例(29%)HPV阳性,91例(71%)阴性。最常见的基因型是HPV 6(n=27,71%),其次是HPV 11(n=10,26%)。1例(1%)HPV阳性但无法确定基因型。在HPV阴性病例中,3例最初报告为HPV 16阳性,但在复查和重复检测后发现为HPV阴性。喉部发生的鳞状细胞乳头状瘤比口腔和口咽部发生的更可能携带HPV(64%对10%,p<0.00001)。同样,复发性呼吸道乳头状瘤病比孤立性鳞状细胞乳头状瘤更可能为HPV阳性(71%对10%,p<0.00001)。几乎三分之一的头颈部鳞状细胞乳头状瘤携带HPV,但发病率高度依赖于解剖部位。那些发生在喉部的比发生在口腔和口咽部的更倾向于由HPV驱动,特别是在复发性呼吸道乳头状瘤病的背景下。在所有病例中均无法确认高危型HPV。常规HPV检测作为揭露含有高危型HPV的潜在恶性病变的策略可能没有用处。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
头颈部鳞状细胞乳头状瘤中HPV的患病率、类型和解剖分布如何?
核心机制
低危型HPV(主要为HPV6和11)驱动部分头颈部鳞状细胞乳头状瘤,尤其是在喉部及RRP背景下;高危型HPV未在SPs中检出,可能不是SPs恶性转化的常见途径。
主要证据
对129例SPs进行实时PCR和Sanger测序,38例(29%)HPV阳性,其中HPV6 27例、HPV11 10例;喉部HPV阳性率(64%)显著高于口腔及口咽部(10%),RRP患者HPV阳性率(71%)显著高于孤立性SPs;所有p16免疫组化阴性,3例初始高危HPV阳性均证实为假阳性。
研究意义
研究结果不支持对良性SPs进行常规高危HPV检测以预测恶性转化的临床实践,强调了低危HPV在SPs中的主要作用,并提示非HPV机制可能参与部分SPs的发生。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

病例筛选与样本收集

确定2012-2018年间西奈山医院所有经过HPV检测的头颈部鳞状细胞乳头状瘤病例,建立研究队列。

通过检索手术病理档案,筛选出134例进行过HPV检测的SPs,其中131例有足够细胞材料,2例因检测结果不确定被排除,最终129例纳入研究。

2

HPV检测与基因分型

检测SPs中HPV的存在,并确定具体基因型,区分低危和高危型HPV。

采用实时PCR检测HPV L1区域进行筛查,阳性样本通过高分辨率熔解曲线分析确认,并用HPV16/18特异性PCR及Sanger测序进行基因分型。

3

高危HPV阳性病例复核

验证初始报告为高危HPV阳性的病例是否为真阳性,排除假阳性。

对高危HPV阳性病例进行切片复查、p16免疫组化染色、原始PCR曲线回顾,并重复PCR检测。

4

数据统计与临床相关性分析

分析HPV状态与人口学特征、解剖部位及临床分类(RRP vs 孤立性SP)的相关性。

收集临床、人口学和病理信息,包括p16免疫组化结果和解剖部位,并进行统计学比较。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Maxwell 16 FFPE组织LEV DNA试剂盒Promega--
NanoDrop ND-2000c分光光度计Thermo Fisher Scientific--
LightCycler 480高分辨率熔解试剂盒----
p16小鼠单克隆抗体MTM Laboratories--
Ultra view聚合物检测试剂盒Ventana Medical Systems--
Ventana BenchMark XT自动染色仪Ventana--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
HPV检测
实时PCR引物(GP5+/GP6+)和检测程序;高分辨率熔解曲线分析条件;HPV16/18特异性PCR引物和探针
阅读提示:Methods: Human Papillomavirus DNA Genotyping
p16免疫组化
p16阳性判读标准(弥漫染色,>75%肿瘤细胞);抗原修复条件(10 mM柠檬酸盐缓冲液,92°C 30分钟)
阅读提示:Methods: p16 Immunohistochemistry
病例选择与分类
纳入标准(2012-2018年西奈山医院进行HPV检测的SPs);RRP定义(连续区域多发融合SP和/或同一部位复发)
阅读提示:Methods: Patients
高危HPV阳性复核
重复PCR检测的条件(新鲜切片);原始PCR曲线阈值(循环阈值40)
阅读提示:Results: 描述3例初始HPV16阳性复核过程;Figure 2 legend