细胞培养与处理
确定SCFAs对EGCs的细胞毒性及HDAC抑制活性,确定后续实验剂量
培养EGCPK060399egfr细胞,使用不同浓度丁酸和丙酸处理,CCK-8测定细胞活力,Western blot检测组蛋白乙酰化
Short-Chain Fatty Acids Elicit Differential Expression of Growth Factors and Pro-Inflammatory Cytokines in Immortalized Rat Enteric Glial Cells
包含细胞系处理、qPCR、Western blot、细胞活力测定及统计分析,但缺乏体内或类器官等独立证据层级,且部分实验样本量小(n=3)
EGCPK060399egfr永生化大鼠肠胶质细胞系
SCFA处理浓度:1 mM和10 mM 处理时间:8、12、24小时(qPCR)及8、12、18、24小时(Western blot) 细胞活力:CCK-8测定,独立实验n=4 qPCR样本量:n=5(GDNF、TGF-β1),n=3(TNFα、IL-6)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定SCFAs对EGCs的细胞毒性及HDAC抑制活性,确定后续实验剂量
培养EGCPK060399egfr细胞,使用不同浓度丁酸和丙酸处理,CCK-8测定细胞活力,Western blot检测组蛋白乙酰化
检测SCFAs对生长因子和细胞因子mRNA表达的影响
处理EGCs后提取RNA,逆转录cDNA,进行qPCR,分析GDNF、TGF-β1、TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA水平
检测SCFAs对生长因子和细胞因子蛋白水平的影响
处理EGCs后裂解细胞,Western blot检测GDNF、TGF-β1、TNFα、IL-6和IL-1β的蛋白水平
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Cytivia | AG29820908 |
| 胎牛血清 | Gibco | 12483-020 | |
| 药物处理 | 丁酸钠 | MilliporeSigma | 303410 |
| 干扰素-γ | Abcam | 280340 | |
| 细胞活力测定 | 细胞计数试剂盒-8 | Abcam | 228554 |
| RNA提取 | RNAqueous-4PCR试剂盒 | Invitrogen | AM1914 |
| RNA浓度测量 | Nanodrop One微量紫外/可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W |
| RNA纯化 | RNA清洗与浓缩5试剂盒 | Zymo Research | R1013 |
| RNA凝胶电泳 | 2x RNA上样缓冲液 | Life Technologies | R0641 |
| SYBR Safe DNA凝胶染料 | Thermo Fisher Scientific | 2687599 | |
| Sub-Cell GT琼脂糖凝胶电泳系统 | Bio-Rad | 1704401 | |
| 凝胶成像 | GelDoc Go成像系统 | Bio-Rad | 12009077 |
| 逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368814 |
| T100热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| qPCR | Quant Studio 5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | 4385612 |
| Fast SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4385612 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| SDS-PAGE | Mini-Protean Tetra电泳槽 | Bio-Rad | 1658000 |
| 蛋白转移 | Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | 1704150 |
| MemCode可逆蛋白染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 24585 | |
| Western blot | 组蛋白H2B抗体 | Cell Signaling Technology | 12364 |
| 乙酰化组蛋白H2B抗体 | Cell Signaling Technology | 12799 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 乙酰化组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9649 | |
| IL-1β抗体 | Abcam | 9722 | |
| IL-6抗体 | Abcam | 9324 | |
| GDNF抗体 | Abcam | 176564 | |
| TGF-β1抗体 | Abcam | 215715 | |
| TNFα抗体 | Abcam | 307164 | |
| Clarity Western ECL底物试剂盒 | Bio-Rad | 170-5061 | |
| Western blot成像 | ChemiDoc XRS成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 微板读数 | BioTek Epoch-2酶标仪 | BioTek | EPOCH2C |
| 统计 | GraphPad PRISM | -- | -- |
| SPSS | IBM | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系:EGCPK060399egfr(ATCC #2690),培养于DMEM+10% FBS,37°C,5% CO2 阅读提示:Methods 2.1 Cell Culture |
| SCFA处理 | 剂量:1 mM和10 mM;处理时间:8, 12, 24h(qPCR),8, 12, 18, 24h(Western blot);有无IFNγ(10 ng/mL) 阅读提示:Methods 2.2 Treatment Conditions |
| 细胞活力 | CCK-8测定,4个独立孔,处理8-24h 阅读提示:Methods 2.3 Cell Viability Assays |
| 基因表达 | qPCR内参基因:GAPDH和actin(几何平均),ΔΔCt法 阅读提示:Methods 2.5 qRT-PCR |
| 蛋白表达 | Western blot抗体:CST和Abcam,蛋白上样量5 μg 阅读提示:Methods 2.6 Western Immunoblotting |