短链脂肪酸在永生化大鼠肠胶质细胞中诱导生长因子和促炎细胞因子的差异表达

Short-Chain Fatty Acids Elicit Differential Expression of Growth Factors and Pro-Inflammatory Cytokines in Immortalized Rat Enteric Glial Cells

作者信息Michelle M Beltran, Danielle M Defries
PMID41683259
期刊Nutrients
发布时间2026-01-29
DOI10.3390/nu18030436

实验完整度

包含细胞系处理、qPCR、Western blot、细胞活力测定及统计分析,但缺乏体内或类器官等独立证据层级,且部分实验样本量小(n=3)

主要模型

EGCPK060399egfr永生化大鼠肠胶质细胞系

重点核对

SCFA处理浓度:1 mM和10 mM 处理时间:8、12、24小时(qPCR)及8、12、18、24小时(Western blot) 细胞活力:CCK-8测定,独立实验n=4 qPCR样本量:n=5(GDNF、TGF-β1),n=3(TNFα、IL-6)

摘要

背景/目标:肠胶质细胞(EGCs)是肠神经系统的非神经元细胞,通过与肠上皮、肠神经元和肠道常驻免疫细胞的相互作用,促进肠道稳态。本研究的目的是确定EGCs暴露于短链脂肪酸(SCFAs)如何影响生长因子和促炎细胞因子的表达,这些因子是EGCs的产物,对肠上皮屏障完整性具有已知作用。方法:用低剂量(1 mM)或高剂量(10 mM)丁酸钠或丙酸钠处理肠胶质细胞系8至24小时,之后使用定量聚合酶链反应测定和Western免疫印迹测量胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、转化生长因子β-1(TGFβ-1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA和蛋白水平。结果:仅丁酸处理8和24小时与GDNF mRNA的适度变化相关。两种SCFA均未引起TGFβ-1 mRNA的变化。尽管如此,高剂量丁酸和丙酸在处理后12小时即与TGFβ-1蛋白的基础水平降低相关。仅丁酸与TNFα基础表达的显著降低相关,该效应持续至处理后24小时。然而,丁酸(低剂量和高剂量)和丙酸(仅高剂量)在所有检查时间点均诱导IL-6表达显著增加。细胞因子mRNA水平的变化未在蛋白水平上反映。结论:SCFAs直接影响EGCs中生长因子和细胞因子的表达,但这些表达变化在复杂的肠道环境中的功能意义仍有待探索。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
SCFAs(丁酸和丙酸)是否直接调节肠胶质细胞中生长因子和促炎细胞因子的表达,从而影响肠道屏障完整性?
核心机制
SCFAs可能通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)调节基因表达,但TGF-β1蛋白降低提示存在转录后调控;文中未明确证明因果机制
主要证据
使用EGCPK060399egfr细胞系,通过qPCR检测mRNA水平,Western blot检测蛋白水平,CCK-8检测细胞活力;高剂量丁酸和丙酸降低TGF-β1蛋白,丁酸降低TNFα mRNA,两种SCFAs均升高IL-6 mRNA
研究意义
研究首次报道SCFAs对肠胶质细胞中生长因子和细胞因子产生的直接作用,提示可能对肠道稳态有影响,但功能意义需体内研究进一步探索

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞培养与处理

确定SCFAs对EGCs的细胞毒性及HDAC抑制活性,确定后续实验剂量

培养EGCPK060399egfr细胞,使用不同浓度丁酸和丙酸处理,CCK-8测定细胞活力,Western blot检测组蛋白乙酰化

2

基因表达检测

检测SCFAs对生长因子和细胞因子mRNA表达的影响

处理EGCs后提取RNA,逆转录cDNA,进行qPCR,分析GDNF、TGF-β1、TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA水平

3

蛋白表达检测

检测SCFAs对生长因子和细胞因子蛋白水平的影响

处理EGCs后裂解细胞,Western blot检测GDNF、TGF-β1、TNFα、IL-6和IL-1β的蛋白水平

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基CytiviaAG29820908
胎牛血清Gibco12483-020
丁酸钠MilliporeSigma303410
干扰素-γAbcam280340
细胞计数试剂盒-8Abcam228554
RNAqueous-4PCR试剂盒InvitrogenAM1914
Nanodrop One微量紫外/可见分光光度计Thermo Fisher ScientificND-ONE-W
RNA清洗与浓缩5试剂盒Zymo ResearchR1013
2x RNA上样缓冲液Life TechnologiesR0641
SYBR Safe DNA凝胶染料Thermo Fisher Scientific2687599
Sub-Cell GT琼脂糖凝胶电泳系统Bio-Rad1704401
GelDoc Go成像系统Bio-Rad12009077
High-Capacity cDNA逆转录试剂盒Thermo Fisher Scientific4368814
T100热循环仪Bio-Rad--
Quant Studio 5实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher Scientific4385612
Fast SYBR Green预混液Thermo Fisher Scientific4385612
RIPA裂解液----
蛋白酶/磷酸酶抑制剂Thermo Fisher Scientific78440
Pierce BCA蛋白测定试剂盒Thermo Fisher Scientific23225
Mini-Protean Tetra电泳槽Bio-Rad1658000
Trans-Blot Turbo转印系统Bio-Rad1704150
MemCode可逆蛋白染色试剂盒Thermo Fisher Scientific24585
组蛋白H2B抗体Cell Signaling Technology12364
乙酰化组蛋白H2B抗体Cell Signaling Technology12799
组蛋白H3抗体Cell Signaling Technology4499
乙酰化组蛋白H3抗体Cell Signaling Technology9649
IL-1β抗体Abcam9722
IL-6抗体Abcam9324
GDNF抗体Abcam176564
TGF-β1抗体Abcam215715
TNFα抗体Abcam307164
Clarity Western ECL底物试剂盒Bio-Rad170-5061
ChemiDoc XRS成像系统Bio-Rad--
BioTek Epoch-2酶标仪BioTekEPOCH2C
GraphPad PRISM----
SPSSIBM--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系:EGCPK060399egfr(ATCC #2690),培养于DMEM+10% FBS,37°C,5% CO2
阅读提示:Methods 2.1 Cell Culture
SCFA处理
剂量:1 mM和10 mM;处理时间:8, 12, 24h(qPCR),8, 12, 18, 24h(Western blot);有无IFNγ(10 ng/mL)
阅读提示:Methods 2.2 Treatment Conditions
细胞活力
CCK-8测定,4个独立孔,处理8-24h
阅读提示:Methods 2.3 Cell Viability Assays
基因表达
qPCR内参基因:GAPDH和actin(几何平均),ΔΔCt法
阅读提示:Methods 2.5 qRT-PCR
蛋白表达
Western blot抗体:CST和Abcam,蛋白上样量5 μg
阅读提示:Methods 2.6 Western Immunoblotting