优化上皮芽分离与培养条件
建立高通量、易于操作的唾液腺上皮外植体培养方法。
采用dispase处理结合多次吹打分离上皮芽，并在96孔超低吸附板中以非凝固Matrigel进行培养。通过比较不同生长因子组合，确定最佳培养条件。
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唾液腺上皮外植体培养中的高效基因敲除
Efficient Gene Knockout in Salivary Gland Epithelial Explant Cultures
实验完整度
高包含培养条件优化、慢病毒生产与转导、多基因敲除验证、蛋白表达分析、形态发生表型观察及基因表达检测等多个独立实验层级，具备明确的功能验证。
主要模型
小鼠胚胎唾液腺上皮外植体 Cas9转基因小鼠来源的唾液腺上皮芽 E13和E16小鼠胚胎
重点核对
上皮芽分离后，在含FGF7 (200 ng/mL) 和ITS的低浓度非凝固Matrigel中培养 慢病毒转导后使用20 µg/mL blasticidin进行抗生素筛选 使用针对Itgb1、Itga9和Serpinh1的多个sgRNA，并验证其敲除效率 通过qPCR检测野生型mRNA水平，通过免疫染色检测目标蛋白表达 在E13和E16胚胎来源的外植体中均评估了分支形态发生
摘要
我们开发了在离体小鼠胚胎唾液腺上皮外植体中实现高效CRISPR-Cas9介导的基因敲除的方法。唾液腺上皮外植体为表征细胞信号传导、分化和上皮形态发生提供了一个有价值的模型，但研究一直受到缺乏高效基因扰动方法的限制。在这里，我们通过将表达引导RNA的慢病毒瞬时转导到从Cas9转基因小鼠分离的Cas9表达唾液腺上皮芽中，证明了高效的基因扰动。我们首先表明，唾液腺上皮外植体可以在96孔板中的低浓度、非凝固Matrigel悬浮液中培养，与传统的包埋在凝固Matrigel中的培养相比，这大大提高了样品通量。我们进一步表明，唾液腺上皮外植体可以仅用FGF7生长和分支，而补充胰岛素、转铁蛋白和硒（ITS）可增强生长和分支。然后，我们描述了一种在分子克隆后1周内产生实验就绪、高效价慢病毒的高效工作流程。为了追踪转导细胞，我们设计了慢病毒载体，使其与引导RNA共表达核荧光报告基因。当使用抗生素选择时，我们常规实现了80%的转导效率。重要的是，在测试3个不同基因的9个引导RNA时，我们检测到靶蛋白产物的强劲丢失。此外，靶向β1整合素基因（Itgb1）抑制了分支形态发生，这支持了细胞-基质粘附在驱动分支形态发生中的重要性。总之，我们建立了一种基于慢病毒的方法，可以高效地扰动唾液腺上皮外植体中的目标基因，这将极大地促进使用该系统研究特定基因功能的研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在小鼠胚胎唾液腺上皮外植体中实现高效的基因敲除，并验证其在研究基因功能中的实用性？
- 核心机制
- lentivirus介导的sgRNA递送在Cas9转基因小鼠来源的唾液腺上皮芽中实现高效基因敲除，β1整合素介导的细胞-基质粘附对分支形态发生至关重要。
- 主要证据
- 使用9个针对Itgb1、Itga9和Serpinh1的sgRNA，通过qPCR和免疫染色验证了基因敲除效率；靶向Itgb1抑制了分支形态发生。
- 研究意义
- 该方法可广泛应用于离体培养中特定基因功能的研究，尤其适用于唾液腺发育和疾病相关基因的分析。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
慢病毒生产与转导优化
建立高效产生sgRNA表达慢病毒并转导上皮芽的方法。
利用一步连接法克隆sgRNA，生产慢病毒，并通过抗生素筛选富集转导细胞。评估转导效率和核报告基因表达。
验证基因敲除效率
评估多个sgRNA对目标基因的敲除效率，并分析蛋白表达降低的动力学。
使用qPCR检测野生型mRNA水平，免疫染色检测目标蛋白表达，并在不同时间点（1, 2, 4, 7天）观察蛋白减少的动态变化。
评估基因敲除对分支形态发生的影响
确定靶向特定基因是否影响唾液腺上皮的分支形态发生。
在E13和E16阶段的外植体中，转导针对Itgb1、Itga9或Serpinh1的sgRNA，并在不同时间点观察芽数变化和形态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 上皮芽分离与培养 | 使用E13或E16小鼠胚胎的下颌下腺，dispase处理时间和吹打力度的控制，Matrigel浓度（400-500 µg/mL），培养时间 阅读提示：Materials and Methods: Mouse Strains and Experiment Design; Results: Salivary Epithelial Bud Isolation and Explant Culture in 96-Well Plates |
| 慢病毒生产与转导 | 慢病毒滴度（约1.5 × 10^8 IFU/mL），转导后的培养时间，抗生素选择浓度（20 µg/mL blasticidin） 阅读提示：Materials and Methods: lentivirus packaging and transduction; Results: Streamlined Production of High-Titer sgRNA-Expressing Lentiviruses |
| 基因敲除效率验证 | sgRNA序列和靶向位点，qPCR引物设计（跨越切割位点），适用于目标基因的免疫染色条件 阅读提示：Materials and Methods: lentivirus packaging and transduction; Results: Knockout of β1 Integrin Inhibits Branching Morphogenesis; Appendix |
| 形态发生分析 | 芽数计数时间点（1, 2, 3, 4, 7天），E16样本使用中心图像平面，样本量（n值） 阅读提示：Results: Knockout of β1 Integrin Inhibits Branching Morphogenesis; Figure legends |