鉴定UBTF-TD染色质相互作用蛋白
鉴定UBTF-TD在染色质上独特的相互作用蛋白，探索异常定位的分子基础。
在K562细胞中表达EV、UBTF-WT和UBTF-TD54，进行qPLEX-RIME质谱分析，并利用TurboID邻近标记验证XPO1、KMT2A等相互作用。
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UBTF串联重复产生依赖XPO1的核输出信号，揭示白血病治疗依赖性
Tandem Duplications in UBTF Create XPO1-Dependent Nuclear Export Signals that Reveal a Leukemic Therapeutic Dependency
实验完整度
高包括体外生化（CD、NMR、SPR、pull-down）、细胞功能（增殖、集落形成、分化）、染色质定位（CUT&RUN）、转录组（RNA-seq）和体内PDX模型验证，多层级证据支持机制和疗效。
主要模型
K562细胞 人脐带血CD34+细胞 UBTF-TD患者来源异种移植（PDX）模型
重点核对
UBTF-TD类型（TD48、TD54、TD84）及NES突变（NES-M） eltanexor处理浓度（25、100 nmol/L）和时间（4、7、11天） 体内PDX模型中eltanexor给药剂量（5、10 mg/kg）及方案（5天给药2天停） CUT&RUN和RNA-seq等分子分析的生物学重复 对照（EV、UBTF-WT、DMSO）
摘要
UBTF串联重复（UBTF-TD）定义了急性髓系白血病（AML）的一个高风险分子亚型。尽管menin抑制剂在UBTF-TD AML中显示出治疗前景，但获得性耐药仍是一个挑战。在本研究中，我们利用蛋白质组学、表观遗传学和功能分析来揭示UBTF-TD白血病发生的机制。生化研究表明，UBTF-TD导致结构不稳定并产生核输出信号（NES）基序，这些基序介导与exportin-1（XPO1）的直接相互作用。在脐带血CD34+ UBTF-TD模型中，这些相互作用被证明驱动了UBTF-TD肿瘤中失调基因的异常染色质结合和转录激活。通过诱变，我们证明了这些NES基序对UBTF-TD蛋白在染色质上的定位、转录失调以及细胞增殖和分化至关重要。在人类白血病的临床前UBTF-TD模型中，我们发现XPO1抑制破坏UBTF-TD的染色质定位，减少肿瘤负担，并促进分化。这些机制性发现强调了XPO1抑制作为UBTF-TD AML潜在治疗方法的可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UBTF-TD驱动的AML中，UBTF-TD蛋白异常定位至染色质区域的机制是什么？以及能否针对该机制进行靶向治疗？
- 核心机制
- UBTF-TD在HMG4结构域产生或暴露核输出信号（NES）基序，使UBTF-TD蛋白与XPO1结合，促进其染色质定位至HOXA/HOXB等基因区域，激活转录，驱动白血病发生。
- 主要证据
- 通过qPLEX-RIME和TurboID鉴定XPO1互作，CD、NMR显示TD导致结构不稳定，SPR和pull-down验证NES基序直接结合XPO1；在cbCD34+细胞中，NES突变（NES-M）减少增殖、自我更新和染色质定位；XPO1抑制剂eltanexor在体外和PDX模型中减少肿瘤负担并促进分化。
- 研究意义
- 该研究揭示UBTF-TD AML中一个可靶向的机制依赖，支持XPO1抑制剂（如eltanexor）作为UBTF-TD AML的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结构分析鉴定NES基序
确定UBTF-TD是否包含功能性NES基序及其结构基础。
对97个UBTF-TD病例序列进行LocNES预测，使用AlphaFold3预测结构，纯化HMG4结构域并通过CD、NMR和XPO1 pull-down评估结构稳定性及XPO1结合。
验证NES基序对细胞增殖和自我更新的影响
评估NES基序在UBTF-TD驱动的增殖和自我更新中的必要性。
在人体脐带血CD34+细胞中过表达UBTF-WT、UBTF-TD或NES-M变体，进行生长曲线、集落形成单位（CFU）检测及流式细胞术分析干/祖细胞和分化标志物。
染色质定位分析
确定NES基序是否影响UBTF-TD在染色质上的定位。
在cbCD34+细胞中表达TD54或TD84及其NES-M变体，进行CUT&RUN分析UBTF-TD、XPO1和H3K27ac的基因组结合，并评估基因表达变化。
体外XPO1抑制剂功能验证
测试XPO1抑制剂eltanexor在体外模型中的效果。
在cbCD34+细胞和PDX来源细胞中，使用eltanexor处理，测量增殖、凋亡、分化标志物表达，并通过CUT&RUN评估染色质定位变化。
体内PDX模型疗效评估
评估eltanexor在体内对UBTF-TD AML的治疗效果。
将荧光素酶标记的UBTF-TD PDX细胞移植至免疫缺陷小鼠，随机分组给予vehicle或eltanexor（5、10 mg/kg）治疗6周，监测肿瘤负担、分化标志物和分子变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| qPLEX-RIME | 蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88845 |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 胰蛋白酶 | Pierce | 90058 | |
| TMTpro标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | A58334 | |
| 超微量离心柱 | Harvard Apparatus | -- | |
| 三乙基碳酸氢铵 | Sigma | T4708 | |
| Dionex UltiMate 3000 | -- | -- | |
| Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质表达与纯化 | pCoofy表达载体 | Addgene | 43974 |
| HiFi组装 | New England Biolabs | E5520S | |
| pGEX XPO1表达构建体 | -- | -- | |
| BL21 (DE3)大肠杆菌 | Millipore | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | GoldBio | I2481C | |
| Ni2+-NTA琼脂糖 | GoldBio | H-350 | |
| 谷胱甘肽琼脂糖 | GoldBio | G-250 | |
| CD和NMR光谱 | NanoDrop 2000c分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C |
| CD光谱 | Jasco J-1500分光仪 | Jasco | -- |
| NMR光谱 | Bruker光谱仪 | Bruker | -- |
| GST pull-down | 磁谷胱甘肽磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 78602 |
| NuPAGE LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Invitrogen | NP0301BOX | |
| SPR | Biacore T200光学生物传感器 | Cytiva | -- |
| His捕获试剂盒 | Cytiva | 28995056 | |
| 细胞培养 | StemSpan SFEMII培养基 | STEMCELL Technologies | 09655 |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| 重组人SCF | PeproTech | -- | |
| 重组人FLT-3 | PeproTech | -- | |
| 重组人TPO | PeproTech | -- | |
| 重组人IL-6 | PeproTech | -- | |
| UM729 | STEMCELL Technologies | 72332 | |
| SR-1 | STEMCELL Technologies | 72344 | |
| 人CD34磁珠分选试剂盒超纯 | Miltenyi Biotec | 130-1-453 | |
| CUT&RUN | CUTANA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | EpiCypher | 14-1048 |
| EasySep小鼠/人嵌合体分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19849 | |
| EasySep死细胞去除试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17899 | |
| 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| H3K27ac抗体 | Cell Signaling Technology | 8173S | |
| H3K4me3抗体 | EpiCypher | 13-0041 | |
| XPO1抗体 | Cell Signaling Technology | 46249 | |
| UBTF抗体 | Abcam | ab244287 | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| IgG抗体 | EpiCypher | 13-0042 | |
| Qubit 2.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Qubit dsDNA高灵敏度定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| CUT&RUN文库制备 | NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7645 |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 安捷伦生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 高灵敏度DNA芯片 | Agilent | 5067-4626 | |
| CUT&RUN测序 | NovaSeq测序仪 | Illumina | -- |
| SP试剂盒v1.5 | Illumina | 20028401 | |
| 集落形成实验 | Methocult H4435甲基纤维素培养基 | STEMCELL Technologies | -- |
| Leica DMi8倒置显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| STEMvision仪器 | STEMCELL Technologies | 22000 | |
| 组织学 | Ventana Discovery Ultra染色系统 | Ventana Medical Systems | -- |
| Ventana反应缓冲液 | Ventana Medical Systems | 950-300 | |
| 细胞调理液2 | Ventana Medical Systems | -- | |
| OmniMap兔检测试剂盒 | Roche | 760-4311 | |
| ChromoMap DAB | Roche | 760-159 | |
| Leica BOND-MAX染色系统 | Leica | -- | |
| BOND洗涤缓冲液 | Leica | AR9590 | |
| 酶修复液2 | Leica | AR9640 | |
| 抗兔Bond聚合物精细检测试剂盒 | Leica | DS9800 | |
| hNuMA1抗体 | Lifespan Biosciences | LS-B11047 | |
| MPO抗体 | Dako | A0398 | |
| MAC1抗体 | Abcam | ab133357 | |
| RNA-seq | Quick-RNA小提试剂盒 | Zymo Research | R1054 |
| Illumina全转录组链特异性RNA制备试剂盒 | Illumina | 20072063 | |
| scRNA-seq | Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| 动物实验 | eltanexor (KPT-8602) | Selleckchem | S8397 |
| NSG-SGM3小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| 流式细胞术 | DAPI | BioLegend | 422801 |
| LSRFortessa II | BD Biosciences | -- | |
| BD FACSymphony A5 SE | BD Biosciences | -- | |
| TurboID邻近标记 | 链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88816 |
| 生物素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| qPLEX-RIME | 细胞处理、抗体、裂解缓冲液、质谱参数 阅读提示：Methods: qPLEX-RIME; Figure 1A |
| 蛋白质表达与纯化 | 蛋白表达菌株、诱导条件、纯化缓冲液 阅读提示：Methods: Protein Expression and Purification |
| CD和NMR光谱 | 蛋白浓度、缓冲液、NMR频率 阅读提示：Methods: CD and NMR Spectroscopy; Figure 2E-F |
| GST pull-down | 蛋白浓度、结合缓冲液、洗脱条件 阅读提示：Methods: GST Pull-Down Experiments; Figure 2G-H |
| SPR | 固定化蛋白水平、分析物浓度范围、流速、再生条件 阅读提示：Methods: SPR; Supplementary Figure S2 |
| 细胞培养 | 培养基配方、细胞因子浓度、培养时间 阅读提示：Methods: Cell Lines and Cell Culture; Figure 3A-D |
| CUT&RUN | 细胞数量、抗体种类和稀释比例、测序深度 阅读提示：Methods: CUT&RUN Assay Protocol, CUT&RUN Library Preparation and Sequencing |
| RNA-seq | RNA提取量、建库试剂盒、测序深度 阅读提示：Methods: Transcriptome Sequencing and Analysis |
| scRNA-seq | 样本处理、建库方法、测序平台 阅读提示：Methods: scRNA-seq Library Generation and Analysis |
| PDX模型 | 细胞数量、移植途径、处理剂量和方案、监测时间点 阅读提示：Methods: Preclinical Modeling of UBTF-TD PDX Model for Eltanexor Treatment; Figure 6A |
| 流式细胞术 | 抗体、染色条件、仪器设置 阅读提示：Methods: Flow Cytometry; Supplementary Table S7 |