iPS细胞分化及表征
建立并验证从iPS细胞分化出内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞和星形胶质细胞的方案。
分化iPS细胞为iECs、iPCs、iSMCs和iASs，通过免疫荧光、qPCR和蛋白质组学进行验证。
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一种完全由iPS细胞衍生的人血脑屏障3D模型，用于探索神经血管疾病机制和治疗干预
A fully iPS-cell-derived 3D model of the human blood-brain barrier for exploring neurovascular disease mechanisms and therapeutic interventions
实验完整度
高包含iPS细胞分化与多组学验证、3D微流控模型构建与功能验证、CRISPR敲除与机制研究、小鼠体内表型对照及LNP治疗挽救实验，形成多个独立证据层级。
主要模型
人iPS细胞来源的3D微流控血脑屏障模型 iPS细胞来源的内皮细胞（iECs） 内皮细胞特异性FOXF2敲除小鼠（Foxf2iECKO）
重点核对
iPS细胞分化方案及细胞纯度 FOXF2敲除效率及克隆特异性 3D培养条件（细胞比例、基质胶、培养时间） LNP处理浓度与时间 TEER测量条件
摘要
血脑屏障（BBB）的完整性对脑稳态至关重要，其功能障碍与神经血管和神经退行性疾病有关。关于BBB功能的机制研究主要在啮齿动物和体外模型中进行，这些模型再现了某些疾病特征，但向人类的转化性有限，并给药物发现带来挑战。在此，我们报告了一种完全由人诱导多能干细胞（iPS）衍生的、微流控三维（3D）BBB模型，由内皮细胞（ECs）、壁细胞和星形胶质细胞组成。我们的模型表达典型命运标志物，在血管样管中形成屏障，并支持灌注，包括用人血灌注。在内皮细胞中删除FOXF2（脑小血管疾病的主要风险基因）诱导了BBB功能障碍的关键特征，包括细胞连接完整性受损和细胞膜穴样内陷形成增强。蛋白质组学分析揭示内吞作用和细胞连接通路失调。疾病特征与内皮细胞特异性Foxf2缺陷小鼠中观察到的表型相似。此外，基于脂质纳米颗粒的Foxf2 mRNA治疗挽救了BBB缺陷，证明了其在药物开发中的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在开发一种完全由人iPS细胞衍生的3D血脑屏障模型，并利用该模型研究FOXF2缺失对BBB功能的影响及其机制，以及测试基于LNP的治疗干预。
- 核心机制
- FOXF2缺陷导致内吞作用（特别是细胞膜穴样内陷介导的）增强和细胞连接（如紧密连接）完整性受损，从而破坏BBB功能。
- 主要证据
- 在3D模型中，FOXF2敲除导致CAV1上调、TJP1下调、通透性增加；蛋白质组学显示内吞和细胞连接通路失调；小鼠模型（Foxf2iECKO）中表型相似；LNP递送Foxf2 mRNA可逆转这些缺陷。
- 研究意义
- 该模型为研究神经血管疾病机制和测试治疗干预提供了可及的人源平台，并展示了其在药物开发中的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
3D BBB模型构建
构建包含所有BBB细胞类型的3D微流控模型，并验证其形态和功能特征。
将iECs、iASs与iPCs或iSMCs以一定比例混合在纤维蛋白水凝胶中，注入微流控芯片，培养形成血管样结构。
FOXF2缺失功能研究
研究FOXF2缺失对BBB功能的影响。
通过CRISPR/Cas9在iPS细胞中敲除FOXF2，分化成iECs后构建3D模型，检测细胞连接、内吞、TEER和通透性等。
体内小鼠模型验证
在体内验证FOXF2缺失的表型。
使用内皮特异性Foxf2敲除小鼠（Foxf2iECKO），分离脑微血管进行免疫荧光和电镜分析。
LNP介导的基因治疗干预
测试LNP递送Foxf2 mRNA是否能挽救FOXF2缺失引起的BBB缺陷。
将封装Foxf2 mRNA的LNPs灌注到3D培养物中，检测CAV1、TJP1水平和内吞活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Essential 8 Flex培养基 | Thermo Fisher Scientific | A2858501 |
| 玻连蛋白 | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
| Geltrex基质胶 | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| StemFlex培养基 | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | |
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| ROCK抑制剂 | Selleckchem | S1049 | |
| IV型胶原 | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| 内皮细胞培养基 | PromoCell | C-22011 | |
| 血管内皮生长因子 | Peprotech | 100-20 | |
| 毛喉素 | Peprotech | 6652995 | |
| CDH5微珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-867 | |
| 平滑肌细胞培养基 | Promocell | C-22062 | |
| 血小板衍生生长因子-BB | Peprotech | 100-14B | |
| 转化生长因子β1 | Peprotech | AF-100-21C | |
| 骨形态发生蛋白4 | Peprotech | AF 120-05ET | |
| 明胶 | Merck Millipore | ES-006-B | |
| DMEM/GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1860 | |
| 转化生长因子β3 | Peprotech | 100-36E | |
| TrypLE | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| Neurobasal培养基 | Thermo Fisher Scientific | 211003-049 | |
| B27补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| N-2补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | 10515 | |
| 多聚鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| 层粘连蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | STEMCELL Technologies | 78003.2 | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | 100-15-100 | |
| 白血病抑制因子 | Peprotech | 300-05-26 | |
| 睫状神经营养因子 | Peprotech | 450-13-20 | |
| 人脑微血管内皮细胞 | ScienceCell | 1000 | |
| 人脑血管周细胞 | ScienceCell | 1200 | |
| 人脑血管平滑肌细胞 | ScienceCell | 1100 | |
| 人星形胶质细胞 | ScienceCell | 1800 | |
| 人脐静脉内皮细胞 | ScienceCell | 8000 | |
| 人脑微血管内皮细胞系D3 | Merck | SCC066 | |
| TEER测量 | CellZscope系统 | Nanoanalytics | -- |
| Milicell ERS 3.0电阻仪 | Merck Milipore | -- | |
| Transwell小室 | Corning | 353095 | |
| 转运体功能测定 | 罗丹明123 | Invitrogen | R302 |
| 阿霉素 | Sigma-Aldrich | D1515-10MG | |
| DCFDA | Thermo Fisher Scientific | D399 | |
| 维拉帕米 | Sigma-Aldrich | V4629-1G | |
| Ko 143 | Sigma-Aldrich | K2144-1MG | |
| MK571 | Sigma-Aldrich | M7571-5MG | |
| 通透性测定 | 10 kDa葡聚糖 | Invitrogen | D1820 |
| 40 kDa葡聚糖 | Invitrogen | D1845 | |
| 70 kDa葡聚糖 | Invitrogen | D1864 | |
| 3D模型构建 | 凝血酶 | Sigma-Aldrich | F8630 |
| 纤维蛋白原 | Sigma-Aldrich | F8630 | |
| 微流控芯片 | AIM Biotech | DAX-1 | |
| 钙成像 | Fluo-4 | AAT Bioquest | 271-20551 |
| 内吞检测 | FM1-43FX | Thermo Fisher Scientific | F35355 |
| 霍乱毒素B亚单位 | Thermo Fisher Scientific | C22841 | |
| 炎症刺激 | 肿瘤坏死因子 | Peprotech | 300-01A-50UG |
| LNP制备 | ALC-0315 | Avanti | 890900O |
| 胆固醇 | Merck | C8667 | |
| ALC-0159 | Avanti Polar Lipids | 8801585P | |
| NanoAssemblr | Precision Nanosystems | -- | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648-5G |
| Mygliol | Caesar & Loretz | 1115805 | |
| 蛋白提取 | TRIzol | QIAGEN | 79306 |
| RNeasy mini试剂盒 | QIAGEN | 74106 | |
| cDNA合成 | Omniscript RT试剂盒 | QIAGEN | 205113 |
| qPCR | SYBR Green预混液 | QIAGEN | 208056 |
| 蛋白质组学 | DIA-NN软件 | -- | -- |
| NanoElute纳升液相色谱 | Bruker | -- | |
| TimsTOF pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| 显微镜 | LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| LSM980共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 电子显微镜 | JEM 1400plus透射电镜 | JEOL | -- |
| Crossbeam Gemini 340扫描电镜 | Zeiss | -- | |
| RNA-seq | SOAPnuke软件 | -- | -- |
| STAR软件 | -- | -- | |
| 样本制备 | Sera-Mag SpeedBeads磁珠 | GE Healthcare | -- |
| LysC蛋白酶 | Promega | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| Qubit蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LNP制备 | 荧光标记DOPE | MedChemExpress | HY-D1556 |
| LNP治疗 | Foxf2 mRNA脂质纳米颗粒 | ISAR Bioscience GmbH | -- |
| tdTomato mRNA脂质纳米颗粒 | ISAR Bioscience GmbH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iPS细胞分化 | iPS细胞系来源、分化培养基和因子浓度 阅读提示：Methods: 'Somatic cell differentiation of iPS cells' |
| 3D模型构建 | 细胞比例、凝胶成分、培养时间及培养基组成 阅读提示：Methods: 'Generation of microfluidic, 3D in vitro BBB model' |
| FOXF2敲除 | CRISPR/Cas9靶序列、编辑效率和克隆验证 阅读提示：Methods: 'CRISPR–Cas9 genome editing' |
| LNP处理 | LNP脂质组成、mRNA浓度、处理剂量和时间 阅读提示：Methods: 'LNP formulation' and 'LNP treatment in vitro' |
| 功能检测 | TEER测量参数、通透性测定所用的dextran分子量及时间点 阅读提示：Methods: 'TEER assay' and 'Dextran assay in two dimensions' |