单细胞RNA-seq数据分析与关键基因鉴定
分析内皮发育关键阶段的单细胞转录组，寻找在内皮分化过程中表达动态变化的潜在调控因子。
对GSE216970数据集进行降维、聚类和伪时间轨迹分析，鉴定在内皮成熟过程中表达逐渐增加的转录因子Atf3。
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Atf3缺陷促进胚胎干细胞向中胚层定向分化并增强内皮细胞分化
Atf3 Deficiency Promotes Mesodermal Commitment and Enhances Endothelial Differentiation in Embryonic Stem Cells
实验完整度
高包含体外细胞模型、基因敲除验证、功能实验（LDL摄取、NO产生）及转录组学分析等多个独立证据层级，并进行了信号通路激活/抑制的功能验证。
主要模型
小鼠胚胎干细胞系 Atf3敲除小鼠胚胎干细胞系 胚状体分化模型
重点核对
Atf3敲除效率验证（Sanger测序、PCR、RT-qPCR、Western blot、免疫荧光） 胚状体形成条件（悬滴法，600细胞/30µL，培养6天） 内皮分化标志物检测时间点（第0、3、6、9天） Rap1信号通路激活剂/抑制剂处理起止时间（分化起始至第9天） 基因表达分析中的样本量（n=5）和统计方法
摘要
背景：缺血性疾病已成为全球健康的主要威胁，内皮细胞损伤与其发病和进展密切相关。靶向内皮修复的细胞疗法因此成为一种备受关注的治疗方法，然而用于这些应用的临床批准内皮细胞的获取尚未完全建立。调节Atf3的表达代表了从干细胞获得内皮细胞的潜在策略；然而，其在干细胞向内皮细胞发育和分化中的确切功能仍不清楚。在本研究中，我们试图阐明Atf3在胚胎干细胞向内皮细胞分化中的潜在作用。方法：使用CRISPR-Cas9系统在小鼠胚胎干细胞中敲除Atf3。最初使用悬滴法促进胚状体形成来诱导内皮细胞分化，随后将胚状体附着到培养载玻片上。通过RNA测序、Western blotting、免疫荧光染色、流式细胞术和逆转录定量聚合酶链反应评估分化过程中内皮细胞标志物的表达变化。通过评估LDL摄取和NO产生来比较分化内皮细胞的功能。通过RNA测序数据的生物信息学分析进一步探索潜在的分子机制。结果：Atf3KO导致分化的第3天和第6天祖细胞和中胚层细胞标志物的表达水平显著上调。到第9天，成熟内皮细胞标志物的表达也显著增加。此外，Atf3KO增强了分化Atf3KO内皮细胞的功能特性。此外，我们的研究结果揭示了由Atf3KO触发的Rap1信号通路的激活，有助于内皮细胞的发育和成熟。结论：Atf3KO引导胚胎干细胞朝向中胚层谱系并激活Rap1信号通路，从而促进内皮细胞发育。这些发现突出了Atf3在调节血管内皮发育早期阶段的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Atf3在小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化过程中的具体作用及潜在机制是什么？
- 核心机制
- Atf3敲除通过激活Rap1信号通路，促进中胚层定向分化和内皮细胞发育与成熟。
- 主要证据
- Atf3敲除后，中胚层和内皮标志物表达上调，内皮细胞功能增强；RNA-seq和GSEA分析显示Rap1通路激活；使用Rap1激活剂和抑制剂处理验证了该通路的功能。
- 研究意义
- 揭示Atf3作为内皮分化的负调控因子，为从干细胞高效诱导成熟内皮细胞，以及心血管疾病的细胞治疗和血管再生提供了新策略和理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建Atf3敲除小鼠胚胎干细胞系
建立Atf3功能缺失的细胞模型，以研究其在内皮分化中的作用。
使用CRISPR-Cas9技术，在mESCs中敲除Atf3基因所有外显子，并通过Sanger测序、PCR、RT-qPCR、Western blot和免疫荧光验证敲除效率。
体外内皮分化诱导与形态学观察
比较WT和Atf3KO mESCs向内皮分化的能力。
采用悬滴法形成EBs，随后贴壁培养至第9天，观察不同时间点的EB形态和分化表型。
中胚层及内皮分化标志物检测
评估Atf3敲除对胚层谱系定向分化和内皮分化的影响。
通过RT-qPCR检测不同分化时间点中胚层、内胚层、外胚层以及内皮祖细胞和成熟内皮标志物的表达；通过Western blot、免疫荧光和流式细胞术检测内皮蛋白表达。
分化内皮细胞功能评估
比较Atf3KO和WT分化内皮细胞的功能成熟度。
通过LDL摄取实验和NO产生检测，评估分化内皮细胞的功能特性。
转录组学分析
揭示Atf3敲除影响内皮分化的分子机制。
对WT和Atf3KO mESCs在分化第0、3、6、9天进行RNA-seq，鉴定DEGs并进行GO、KEGG和GSEA富集分析。
Rap1信号通路功能验证
验证Atf3敲除是否通过激活Rap1信号通路促进内皮分化。
使用Rap1特异性抑制剂ESI-09和激活剂8-pCPT-2'-O-Me-cAMP-AM处理WT和Atf3KO细胞，通过Western blot、免疫荧光和RT-qPCR检测Rap1和内皮标志物的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与细胞模型构建
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | BasalMedia | -- | |
| 非必需氨基酸 | GIBCO | -- | |
| GlutaMAX补充剂 | GIBCO | -- | |
| β-巯基乙醇 | GIBCO | -- | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | -- | |
| CHIR99021 | Sigma | -- | |
| PD0325901 | Sigma | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO | -- | |
| 基因编辑 | PX330-sgRNA-Cas9质粒 | AisenGene Bioscience | -- |
| PGK-Puro-BPA质粒 | AisenGene Bioscience | -- | |
| RT-qPCR | FastPure RNA快速提取试剂盒 | Vazyzme | -- |
| HiScript IV cDNA逆转录试剂盒 | Vazyzme | -- | |
| ChamQ Blue SYBR Green qPCR预混液 | Vazyzme | -- | |
| 免疫荧光 | 抗Cd31抗体 | Cell Signaling | 3528S |
| 抗Atf3抗体 | Abcam | ab254268 | |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Abcam | ab150116 | |
| 流式细胞术 | 抗Cd31抗体 | BD Biosciences | 562939 |
| 抗Cdh5抗体 | BD Biosciences | 562242 | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 抗Cd31抗体 | Cell Signaling | 3528S | |
| 抗Rap1抗体 | Cell Signaling | 2399S | |
| 抗Gapdh抗体 | Proteintech | 60004-1-ig | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10094-1-AP | |
| 功能检测 | Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白 | -- | -- |
| DAF-FM DA探针 | -- | -- | |
| RNA-seq | TriZol试剂 | -- | -- |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | BasalMedia | -- |
| 信号通路验证 | ESI-09 | -- | 263707-16-0 |
| 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP-AM | -- | -- | |
| 显微镜 | 激光共聚焦显微镜LSM 880 | Zeiss | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪Cytoflex LX | Beckman Coulter | -- |
| Western blot | 勤翔成像系统 | Clinx Science Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA-seq数据分析 | 数据来源GSE216970；质控标准（线粒体基因<20%，基因数200-6000）；Seurat v5.2.1和Monocle3 v1.3.7分析参数；轨迹起始细胞选择 阅读提示：详见Methods中“Single-Cell RNA-Seq Data and Pseudotime Trajectory Analysis”小节 |
| mESC培养与Atf3敲除 | mESC来源（AisenGene Bioscience）；培养条件（高糖DMEM，15% FBS，1 mmol/L丙酮酸钠，1 mmol/L非必需氨基酸，1 mmol/L GlutaMAX，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，1000 U/mL LIF，3 µM CHIR99021，1 µM PD0325901）；CRISPR-Cas9质粒和供体载体（PX330-sgRNA-Cas9，PGK-Puro-BPA）；敲除效率验证方法 阅读提示：详见Methods中“mESC Culture, Atf3KO, and In Vitro Differentiation From EBs”小节及图1F-G、图S2 |
| EB形成与内皮分化 | 悬滴法参数（600细胞/30 µL，培养6天）；分化培养基成分（高糖DMEM，20% FBS，1 mmol/L丙酮酸钠，1 mmol/L非必需氨基酸，1 mmol/L GlutaMAX，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，100×青霉素-链霉素）；贴壁培养条件（12孔板，每孔2滴，培养3天） 阅读提示：详见Methods中“mESC Culture, Atf3KO, and In Vitro Differentiation From EBs”小节 |
| 基因表达分析 | RT-qPCR引物序列（表S2）；RNA提取和逆转录试剂盒（FastPure RNA快速提取试剂盒，HiScript IV cDNA逆转录试剂盒，ChamQ Blue SYBR Green qPCR Master Mix）；内参基因（actin）；Western blot抗体（Cd31, Rap1, Gapdh, β-tubulin）；免疫荧光抗体（Cd31, Atf3）及稀释比例；流式抗体（Cd31, Cdh5）及稀释比例；样本量（n=5） 阅读提示：详见Methods中“Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction”、“Immunofluorescence Staining and Flow Cytometry”、“Western Blot”小节 |
| 内皮细胞功能评估 | Dil-Ac-LDL浓度（20-50 µg/mL）和处理时间（4小时）；DAF-FM DA染色浓度和处理时间（37°C，20分钟）；显微镜设置（LSM 880，激发/发射549/565 nm）；样本量（n=11或16） 阅读提示：详见Methods中“Dil-Ac-LDL Uptake Assay”和“Detection of NO”小节 |
| RNA-seq分析 | RNA提取方法（TriZol）；测序服务提供商（HaploX Biotechnology Co）；比对软件（HISAT2）；DEG标准（log fold change>1，adjusted P<0.05）；富集分析工具（GSEA, GO, KEGG）；样本量（n=3） 阅读提示：详见Methods中“RNA Sequencing”小节 |
| Rap1信号通路验证 | Rap1激活剂（8-pCPT-2'-O-Me-cAMP-AM）和抑制剂（ESI-09）的浓度和处理时间；处理起始时间（分化起始）；Western blot抗体（Rap1, Cd31）；RT-qPCR引物（Rap1a, Rap1b, Vegfr2, Cdh5, Vwf, Tie2）；样本量（n=5） 阅读提示：详见Results中“Atf3KO Promotes ECs Development by Regulating the Rap1 Signaling Pathway”小节及图6、图S6-S7 |
| 统计分析 | 统计软件（GraphPad Prism v10.0.0）；数据表示（mean±SEM）；检验方法（Student t检验、Wilcoxon秩和检验、单因素或双因素方差分析、Tukey事后检验）；显著性水平（P<0.05） 阅读提示：详见Methods中“Statistical Analysis”小节 |