转录组和代谢组分析
鉴定舒尼替尼处理肾癌细胞后改变的代谢通路
对786-O细胞进行RNA-seq和LC-MS/MS代谢物分析，比较处理组和对照组，鉴定丝氨酸合成通路上调。
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从头丝氨酸合成是可用于克服晚期肾细胞癌舒尼替尼耐药性的代谢脆弱性
De Novo Serine Synthesis Is a Metabolic Vulnerability That Can Be Exploited to Overcome Sunitinib Resistance in Advanced Renal Cell Carcinoma
实验完整度
高包含体外细胞实验、代谢组学、体内异种移植模型、斑马鱼模型及患者样本验证，并进行了机制和功能验证。
主要模型
786-O肾癌细胞系 RCC10肾癌细胞系 A498肾癌细胞系 患者来源的原代肾癌细胞
重点核对
786-O细胞采用PSAT1 siRNA或CRISPR-Cas9敲除 舒尼替尼浓度2.5 μmol/L处理48小时 NCT-503浓度30 μmol/L 异种移植模型中舒尼替尼剂量40 mg/kg口服 斑马鱼模型注射细胞后48小时评估
摘要
Sunitinib is an oral tyrosine kinase inhibitor used in treating advanced renal cell carcinoma (RCC) that exhibits significant efficacy but faces resistance in 30% of patients. Identifying the molecular mechanisms underlying resistance could enable the development of strategies to enhance sunitinib sensitivity. In this study, we showed that sunitinib induces a metabolic shift leading to increased serine synthesis in RCC cells. Activation of the GCN2-ATF4 stress response pathway was identified as the mechanistic link between sunitinib treatment and elevated serine production. The increased serine biosynthesis supported nucleotide synthesis and sustained cell proliferation, migration, and invasion following sunitinib treatment. Inhibiting key enzymes in the serine synthesis pathway, such as phosphoglycerate dehydrogenase and phosphoserine aminotransferase 1, enhanced the sensitivity of resistant cells to sunitinib. Beyond RCC, similar activation of serine synthesis following sunitinib treatment occurred in a variety of other cancer types, suggesting a shared adaptive response to sunitinib therapy. Together, this study identifies the de novo serine synthesis pathway as a potential target to overcome sunitinib resistance, offering insights into therapeutic strategies applicable across diverse cancer contexts. Significance: Sunitinib treatment induces metabolic reprogramming to provide essential metabolite building blocks for tumor survival, resistance, and progression by upregulating serine biosynthesis, which represents a targetable dependency to enhance therapeutic efficacy.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 舒尼替尼耐药性背后的分子机制是什么，如何增强其敏感性？
- 核心机制
- 舒尼替尼激活GCN2-eIF2α-ATF4应激通路，上调丝氨酸合成酶（PSAT1、PSPH），增强从头丝氨酸合成，支持核苷酸合成和细胞增殖、迁移、侵袭，导致耐药。
- 主要证据
- RNA-seq和代谢组学显示舒尼替尼处理上调丝氨酸合成通路；功能实验表明抑制PHGDH或PSAT1减少增殖、迁移和侵袭；体内异种移植和斑马鱼模型证实PSAT1缺失抑制肿瘤生长和转移；患者样本中观察到相同通路激活。
- 研究意义
- 研究提出靶向丝氨酸合成通路可克服舒尼替尼耐药，适用于多种癌症类型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
丝氨酸合成通路的验证
验证舒尼替尼诱导的丝氨酸合成是否通过关键酶表达增加
通过qPCR和免疫印迹检测PHGDH、PSAT1、PSPH表达；使用13C6-葡萄糖示踪检测丝氨酸从头合成速率。
机制探索：ISR通路
确定ISR通路在舒尼替尼诱导丝氨酸合成中的作用
检测GCN2、eIF2α磷酸化和ATF4蛋白水平；使用siRNA敲低GCN2或ATF4观察对PSAT1和PSPH表达的影响。
功能验证：增殖和核苷酸合成
评估抑制丝氨酸合成对舒尼替尼敏感性和核苷酸合成的影响
使用NCT-503抑制PHGDH，siRNA敲低PHGDH、PSAT1或PSPH，检测细胞增殖、集落形成和RNA合成（14C-葡萄糖掺入）。
功能验证：迁移和侵袭
评估丝氨酸合成对肾癌细胞迁移和侵袭能力的影响
通过划痕实验和球体侵袭实验，检测siRNA敲低PSAT1或NCT-503处理后细胞的迁移和侵袭能力。
体内验证
在体内模型中验证丝氨酸合成通路对肿瘤生长和转移的影响
建立786-O细胞皮下异种移植模型，舒尼替尼处理，检测肿瘤代谢物；利用斑马鱼模型注射PSAT1敲除或敲低细胞，评估肿瘤生长和转移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 舒尼替尼 | -- | -- |
| NCT-503 | MedChemTronica | HY-101966 | |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 肾上皮细胞生长培养基2 | PromoCell | -- | |
| 含有GlutaMAX的最低必需培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 细胞计数 | ADAM-MC细胞计数仪 | NanoEntek | -- |
| 细胞增殖检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 蛋白质印迹 | Triton裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| Laemmli缓冲液 | -- | -- | |
| 硝酸纤维素转印膜 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Promega, Abgent | W4011, W4021 | |
| ECL化学发光检测系统 | Promega, Abgent | W4011 | |
| Western blot | 抗PHGDH抗体 | Proteintech | 14719-1-AP |
| 抗PSPH抗体 | Proteintech | 14513-1-AP | |
| 抗SHMT1抗体 | Proteintech | 14149-1-AP | |
| 抗SHMT2抗体 | Proteintech | 11099-1-AP | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| 抗GCN2抗体 | Cell Signaling Technology | #3302 | |
| 抗磷酸化eIF2抗体 | Cell Signaling Technology | #3398 | |
| 抗ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | #11815 | |
| 抗S6K抗体 | Cell Signaling Technology | #9202 | |
| 抗HSP60抗体 | Cell Signaling Technology | #12165 | |
| 抗HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | #4877 | |
| 抗磷酸化GCN2抗体 | Abcam | #75836 | |
| 抗eIF2抗体 | Abcam | #5369 | |
| 抗PSAT1抗体 | Invitrogen | PA5-22124 | |
| RNA-seq | RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| SOAPnuke软件 | BGI Genomics | -- | |
| HISAT软件 | -- | -- | |
| qPCR | QuantiTect逆转录试剂盒 | QIAGEN | -- |
| SYBR MasterMix Plus试剂 | Eurogentec | -- | |
| 代谢物分析 | 13C6-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8367-PK |
| 15N-氨基-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 液相色谱-串联质谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| UltiMate 3000高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| XBridge酰胺色谱柱 | Waters | -- | |
| 无糖DMEM | US Biological | D9800-02 | |
| N-EVAP氮吹仪 | Organomation | -- | |
| Xcalibur 4.1软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TraceFinder 4.1软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢通路分析 | MetaboAnalyst软件 | -- | -- |
| 动物实验 | 裸鼠 | Janvier | -- |
| siRNA转染 | siRNA靶向PSAT1 | Dharmacon | -- |
| 对照siRNA | Dharmacon | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 酶解分离 | 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- |
| 胶原酶 | -- | -- | |
| 分散酶 | -- | -- | |
| CRISPR-Cas9 | pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)质粒 | Addgene | plasmid #48138 |
| 聚乙烯亚胺转染试剂 | Polyplus transfection | -- | |
| BD FACSMelody流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 斑马鱼模型 | 三卡因（MS-222） | Sigma-Aldrich | -- |
| Vybrant DiD细胞标记液 | Life Technologies | -- | |
| Eppendorf显微注射器FemtoJet 5247 | Eppendorf | -- | |
| MM33-Right操纵器 | Märzhäuser Wetziar | -- | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管针 | -- | -- | |
| Nikon Eclipse C1荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7.0软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、血清浓度、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| 药物处理 | 舒尼替尼浓度（2.5 μmol/L）和处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: 药物处理，Results 相关图注 |
| 蛋白质印迹 | 抗体稀释比例、封闭条件、洗涤缓冲液成分 阅读提示：Materials and Methods: Immunoblotting |
| 实时荧光定量PCR | 引物序列、内参基因（RPLP0）、相对定量方法 阅读提示：Materials and Methods: qPCR experiments，Table 1 |
| 代谢组学分析 | 提取方法、色谱条件、质谱参数 阅读提示：Materials and Methods: Metabolite profiling for targeted steady-state and flux analyses |
| 异种移植动物模型 | 小鼠品系、细胞接种数量、给药剂量和时间 阅读提示：Materials and Methods: Ectopic model of RCC |
| 斑马鱼模型 | 胚胎品系、注射细胞数、处理浓度和观察时间 阅读提示：Materials and Methods: Zebrafish tumor model |