缺氧对STING表达及通路活性的影响
确定缺氧是否影响癌细胞中STING的表达及通路激活。
将多种人类癌细胞系（H1975、HCC827等）暴露于1% O2，通过Western blot和RT-PCR检测STING蛋白和mRNA水平，并检测p-STAT1等通路激活标志物。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
缺氧通过沉默癌症中的STING诱导免疫抑制
Hypoxia Induces Immunosuppression by Silencing STING in Cancer
实验完整度
高包含体外细胞模型、免疫健全小鼠模型、患者样本分析（TCGA）等多个独立证据层级，并进行了功能验证（STING激动剂、免疫原性细胞死亡）和机制验证（表观遗传、代谢物）。
主要模型
H1975非小细胞肺癌细胞系 KPC小鼠胰腺癌细胞系及C57BL/6J同系小鼠模型 MDA-MB-231乳腺癌细胞系异种移植瘤模型
重点核对
细胞系暴露于1% O2的时间（如H1975细胞5周） KPC细胞在植入前于1% O2下培养4周，并确认STING下调 DMXAA给药剂量（300 μg，瘤内注射） KPC细胞植入数量（1.5 × 10^6） 组内样本量（每组10只小鼠）
摘要
干扰素基因刺激因子（STING）是cGAS/STING通路的关键组成部分，对于核酸感知至关重要，并在肿瘤免疫应答中发挥重要作用。然而，STING在多种癌症中常被沉默，从而促进肿瘤发展。本研究表明，肿瘤缺氧在多种癌症类型中下调STING，抑制下游通路并抑制免疫原性细胞死亡。缺氧诱导的STING下调以HIF-1α依赖性方式发生，STING沉默与赖氨酸去甲基化酶KDM1A和KDM5A介导的表观遗传修饰相关，并因肿瘤代谢物失调而进一步加剧。在体内，缺氧影响STING激动剂对肿瘤生长和免疫应答的功效。抑制KDM1A可逆转缺氧诱导的STING下调，并在先前受抑制的癌细胞中重新激活STING。本研究强调了缺氧、肿瘤代谢物和癌症中免疫信号传导之间的相互作用，并表明靶向KDM1A可恢复STING通路并提高癌症治疗的疗效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤缺氧是否以及如何导致STING表达沉默，从而影响抗肿瘤免疫应答？
- 核心机制
- 缺氧通过HIF-1α依赖方式上调KDM1A和KDM5A，导致STING启动子H3K4去甲基化、H3K27去乙酰化及DNA甲基化，同时缺氧诱导的2-HG积累和BCAT1上调进一步促进表观遗传沉默。
- 主要证据
- 体外长期缺氧暴露降低多种癌细胞系STING表达并抑制IFN信号；体内，缺氧KPC肿瘤对STING激动剂DMXAA反应性降低，STING敲除模拟缺氧表型；KDM1A敲低或抑制可恢复STING表达及信号传导。
- 研究意义
- 本研究揭示缺氧、肿瘤代谢物和免疫信号之间的相互作用，并提出靶向KDM1A以恢复STING通路是提高癌症治疗疗效的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证STING下调对免疫信号及免疫原性细胞死亡的影响
评估STING下调是否削弱干扰素应答和免疫原性细胞死亡。
对常氧和缺氧的H1975细胞使用STING激动剂（diABZI）、cGAS激动剂（ISD）及化疗药物（多柔比星）处理，检测ISG表达及calreticulin表面暴露。
缺氧诱导STING下调的机制解析
探究缺氧导致STING沉默的表观遗传和代谢机制。
使用qChIP分析STING启动子组蛋白修饰，通过shRNA敲低KDM1A、KDM5A或HIF1α，并检测BCAT1敲除或过表达及2-HG处理对STING表达的影响。
体内验证缺氧对STING激动剂疗效的影响
在免疫健全小鼠模型中评估缺氧是否影响STING激动剂的抗肿瘤效果和免疫应答。
将常氧或缺氧培养的KPC细胞植入C57BL/6J小鼠，肿瘤达200 mm³后用DMXAA处理，监测肿瘤生长和生存期，并通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞。
KDM1A抑制对STING恢复的影响
检测KDM1A敲低或药理学抑制能否逆转缺氧诱导的STING沉默并恢复其功能。
在缺氧H1975、KPC及其他癌细胞系中敲低KDM1A或用SP2509处理，检测STING表达和信号通路激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | ATCC | -- |
| MEGM™乳腺上皮细胞生长培养基套件™ | ATCC | CC-3150 | |
| 气道上皮细胞基础培养基 | ATCC | PCS-300-040 | |
| 支气管上皮细胞生长试剂盒 | ATCC | PCS-300-040 | |
| 药物处理 | (2R)-辛基-α-羟基戊二酸 | Cayman Chemical | 16366 |
| Poly(dA:dT)/LyoVec™ | Invivogen | tlrl-patc | |
| ISD/LyoVec™ | Invivogen | tlrl-isdc | |
| Poly(I:C)（低分子量）/LyoVec™ | Invivogen | tlrl-picwlv | |
| Poly(I:C)（高分子量）/LyoVec™ | Invivogen | tlrl-piclv | |
| diABZI | Selleckchem | S9616 | |
| 多柔比星（阿霉素）盐酸盐 | Selleckchem | S1208 | |
| DMXAA | Selleckchem | S1537 | |
| 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 | Selleckchem | S1200 | |
| SP2509 | Selleckchem | S7680 | |
| 细胞分离 | 小鼠细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-694 |
| 肿瘤解离试剂盒，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | |
| CD90.2微珠，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-121-278 | |
| 基因敲低 | 针对KDM1A的shRNA载体 | Sigma-Aldrich | TRCN0000046068 |
| 小鼠慢病毒shRNA载体靶向KDM1A | Sigma-Aldrich | TRCN0000071375 | |
| 人慢病毒shRNA载体靶向MDA5 | Sigma-Aldrich | TRCN0000050852 | |
| 基因敲除 | BCAT1基因敲除试剂盒 | OriGene Technologies, Inc. | KN419229 |
| 小鼠STING基因敲除试剂盒 | OriGene Technologies, Inc. | KN517757 | |
| 基因敲低 | C6orf150 (MB21D1)（cGAS）人shRNA质粒试剂盒 | OriGene Technologies, Inc. | TL305813 |
| 基因过表达 | BCAT1表达载体 | OriGene Technologies, Inc. | RC219229 |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Sigma | -- | |
| 蛋白质印迹 | β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | C4 |
| 抗BCAT1抗体 | LSBio | LS-B11204-50 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling | 13647 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling | 37829 | |
| 抗IRF-7抗体 | Cell Signaling | 13014 | |
| 抗磷酸化IRF-7抗体 | Cell Signaling | 5184 | |
| 抗STAT1抗体 | Cell Signaling | 13014 | |
| 抗磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling | 13014 | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling | 13647 | |
| 抗STING抗体（小鼠） | Cell Signaling | 50494 | |
| 抗LSD1 (KDM1A)抗体 | Cell Signaling | 2139 | |
| 抗JARID1A (KDM5A)抗体 | Cell Signaling | 3876 | |
| MDA5抗体 | Cell Signaling | 5321 | |
| 抗HIF1α抗体 | Cell Signaling | 36169 | |
| 抗cGas抗体 | Cell Signaling | 15102 | |
| RNA提取 | Absolutely RNA®小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | AB Applied Biosystems | -- |
| qPCR | Taqman通用PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | FACSAria细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 抗CA9抗体 | R&D | MAB2188F | |
| 抗calreticulin抗体 | abcam | ab196159 | |
| 免疫荧光 | 抗STING抗体（Alexa Fluor® 647） | Cell Signaling Technology | 90173 |
| 抗CA9抗体 | LS-Bio | LS-B7323 | |
| 山羊抗兔IgG二抗（H+L），DyLight™ 488 | Vector Laboratory | DI1488 | |
| 染色质免疫沉淀 | 抗乙酰化K9 H3抗体 | Millipore | 07-352 |
| 抗三甲基K9 H3抗体 | Millipore | 17-625 | |
| 抗单甲基K4 H3抗体 | Millipore | 07-463 | |
| 抗二甲基K4 H3抗体 | Millipore | 07-030 | |
| 抗三甲基K4 H3抗体 | Abcam | ab8580 | |
| 抗三甲基H3K27抗体 | Millipore | 07-449 | |
| 抗乙酰化K27 H3抗体 | Abcam | ab4729 | |
| 抗MeCP2抗体 | Abcam | ab19539 | |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| DNA甲基化分析 | EpiJET亚硫酸氢盐转化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1461 |
| PCR | Phusion U热启动DNA聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F555S |
| 代谢物分析 | 1290超高效液相色谱模块 | Agilent Technologies | -- |
| 6490三重四极杆质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Acquity HSS-T3色谱柱（1.8 μm，2.1 × 50 mm） | Waters Corp. | -- | |
| 细胞分选 | 小鼠细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-694 |
| 肿瘤浸润免疫细胞分析 | 肿瘤解离试剂盒，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 |
| 流式细胞术 | BD FACSymphony A5流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 抗CD4抗体（克隆RM4-5） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD8a抗体（克隆53-6.7） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CCR7抗体（克隆4B12） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD45抗体（克隆30-F11） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD119抗体（克隆GR20） | BD Biosciences | -- | |
| 抗LY6G抗体（克隆1A8-GR1） | BD Biosciences | -- | |
| 抗B220抗体（克隆RA3-6B2） | BD Biosciences | -- | |
| 抗MHCII抗体（克隆M5/114.15.2） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD11c抗体（克隆HL3） | BD Biosciences | -- | |
| 抗Ly6C抗体（克隆AL-21） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD11b抗体（克隆M1/70） | BD Biosciences | -- | |
| 抗IgM抗体（克隆11/41） | eBioscience | -- | |
| 抗CD3e抗体（克隆500A2） | eBioscience | -- | |
| 抗F4/80抗体（克隆BMB） | eBioscience | -- | |
| 抗CD25抗体（克隆PC61） | BioLegend | -- | |
| 抗FoxP3抗体（克隆MF-14） | BioLegend | -- | |
| 细胞活力检测 | Viakrome 808活力染料 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件（培养基、血清），缺氧暴露的O2浓度（1%）和时间 阅读提示：Materials and Methods: Cells, Hypoxia exposure |
| 药物处理 | 药物浓度和处理时间，例如diABZI（0.5 μM）、ISD（2 μg/mL）、多柔比星（0.5 μM）和DMXAA（300 μg） 阅读提示：Materials and Methods: Reagents, Results: 图1D、图2A、图5E |
| 基因操作 | shRNA或敲除载体（KDM1A、KDM5A、HIF1α等）、转染或转导方法、筛选标记 阅读提示：Materials and Methods: Constructs |
| 体内实验 | 小鼠品系、性别、年龄、细胞接种数量、肿瘤体积起始处理标准、DMXAA给药途径和剂量 阅读提示：Materials and Methods: KPC pancreatic cancer model, Results: 图5D-E |