PROX1表观遗传去抑制验证
验证PROX1在NEPC中是否通过PRC2介导的表观遗传去抑制而表达上调。
整合H3K27me3 CUT&Tag和RNA-Seq数据，分析PROX1启动子区域染色质状态；在NEPC类器官中进行CUT&RUN检测H3K27me3和H3K4me3（双价标记）；EZH2敲除或抑制后检测PROX1表达。
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PROX1的表观遗传去抑制促进神经内分泌前列腺癌进展
Epigenetic Derepression of PROX1 Promotes Neuroendocrine Prostate Cancer Progression
实验完整度
高包含CRISPR筛选、基因敲除和过表达、体内移植瘤模型、转录组和CUT&RUN分析、免疫沉淀-质谱及药物抑制等多层级验证。
主要模型
NEPC患者来源类器官（WCM154、WCM1078等） 前列腺腺癌细胞系（C4-2、22Rv1） 去势NSG小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
PROX1敲除对NEPC类器官生长的影响（通过CRISPR-Cas12a） PROX1过表达对PRAD细胞系（C4-2、22Rv1）增殖和转移的影响 CHEK1和CDK2抑制剂（prexasertib和tagtociclib）对NEPC细胞活力的影响 PROX1磷酸化位点突变（S654、S719、S727）对其稳定性和功能的影响
摘要
前列腺癌从腺癌向神经内分泌前列腺癌（NEPC）的组织学转化与侵袭性疾病和不良预后相关。这种谱系转变伴随着Polycomb复合物2（PRC2）介导的细胞命运决定转录因子（包括prospero-homeobox 1（PROX1））的表观遗传去抑制。在此，我们试图功能性地表征PROX1在NEPC中的作用。在两个NEPC患者来源类器官模型中进行的一项无偏CRISPR筛选显示，细胞对PROX1高度依赖。PROX1的敲除阻碍了NEPC模型中的肿瘤生长，而PROX1的过表达促进了前列腺腺癌中的肿瘤生长和自发转移。跨去势抵抗性腺癌和神经内分泌模型的转录组和染色质组分析指出，PROX1介导神经内分泌谱系转录程序调控。免疫沉淀后质谱分析鉴定了PROX1 DNA结合域中对其稳定性和功能至关重要的三个磷酸化位点。CHEK1和CDK2被预测为磷酸化PROX1的上游激酶，且使用CHEK1或CDK2抑制剂处理可降低NEPC活力。总之，这些结果证实了PROX1在NEPC中的作用，并鉴定了DNA结合域中的PROX1磷酸化，这可能代表NEPC中的一个治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PROX1在神经内分泌前列腺癌（NEPC）进展和谱系可塑性中的功能作用及其潜在治疗靶点是什么？
- 核心机制
- PROX1通过调控神经内分泌谱系转录网络（如ASCL1、NEUROD1）促进NEPC进展，其功能受DNA结合域磷酸化（S654、S719、S727）调控，上游激酶CHEK1和CDK2可能介导这些磷酸化。
- 主要证据
- CRISPR筛选显示NEPC对PROX1高度依赖；体内移植瘤模型证实PROX1敲除抑制生长、过表达促进生长和转移；转录组和CUT&RUN分析显示PROX1调控神经内分泌基因；免疫沉淀-质谱鉴定磷酸化位点，药物抑制CHEK1/CDK2降低NEPC活力。
- 研究意义
- 该研究证实PROX1是NEPC的潜在治疗靶点，并提示靶向CHEK1或CDK2可能通过影响PROX1磷酸化提供治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CRISPR筛选和功能验证
确定NEPC对PROX1的依赖性并验证其功能。
在两个NEPC类器官中进行CRISPR-Cas12a筛选；在WCM154中敲除PROX1，检测体外和体内生长；通过dTAG系统进行PROX1拯救和降解实验，评估细胞活力。
PROX1过表达对PRAD肿瘤生长和转移的影响
验证PROX1过表达是否驱动前列腺腺癌的肿瘤进展和神经内分泌分化。
在C4-2和22Rv1细胞中稳定过表达PROX1，植入去势小鼠，监测肿瘤生长、自发转移和神经内分泌标记物表达。
转录组和CUT&RUN分析
阐明PROX1调控的基因表达程序和直接转录靶点。
对PROX1过表达或敲除模型进行RNA-Seq，分析差异表达基因和通路；进行PROX1 CUT&RUN识别全基因组结合位点。
PROX1磷酸化鉴定和上游激酶预测
鉴定PROX1的翻译后修饰，并探索其功能调控机制。
免疫沉淀PROX1后质谱分析磷酸化位点；通过点突变验证位点功能；使用激酶文库预测上游激酶并用抑制剂验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | -- | |
| 活性炭剥离胎牛血清 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基（高糖） | Life Technologies | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶（减少生长因子） | Corning | -- |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Invitrogen | -- | |
| GlutaMAX补充剂 | Invitrogen | -- | |
| HEPES缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| B27补充剂 | Gibco | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小鼠重组EGF | Peprotech | -- | |
| 人重组FGF-10 | Peprotech | -- | |
| 人重组FGF-basic | Peprotech | -- | |
| A-83-01 | Tocris | -- | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 前列腺素E2 | Tocris | -- | |
| NRG | GenScript | -- | |
| Y-27632-2HC1 | Selleck | -- | |
| Noggin条件培养基 | -- | -- | |
| R-spondin条件培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | 他泽美司他 | xcessbio | M60122-10S |
| 他格托西利布 | selleckchem | S9878 | |
| 普瑞色替布 | selleckchem | S7178 | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞培养检测 | ABM支原体PCR检测试剂盒 | ABM | G238 |
| Western blot | RCDC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| NuPAGE Novex凝胶电泳 | Life Technologies | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | NuPAGE | -- | |
| PROX1抗体 | abcam | ab199359 | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 11846S | |
| ASCL1抗体 | abcam | ab211327 | |
| CHGA抗体 | abcam | ab15160 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S | |
| LI-COR二抗 | LI-COR | -- | |
| LI-COR Odyssey M成像系统 | LI-COR | -- | |
| Restore Plus Western blot剥离缓冲液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 免疫组化 | 伊红Y | Anatech | 832 |
| Leica Bond III自动化染色平台 | Leica | -- | |
| Leica Biosystems Refine检测试剂盒 | Leica | DS9800 | |
| Leica AR9222脱蜡液 | Leica | AR9222 | |
| HistoreCore Spectra CV封片剂 | Leica | 3801733 | |
| 嗜铬粒蛋白A抗体 | Thermo/Neomarkers | MS-324 | |
| 雄激素受体抗体 | Dako | M3562 | |
| INSM1抗体 | Biocare | ACI 3299 | |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo检测 | Promega | -- |
| 免疫共沉淀 | IGEPAL CA-630去垢剂 | Millipore-Sigma | CA-630 |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| Dynabeads蛋白G/蛋白A磁珠 | -- | -- | |
| IgG对照抗体 | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| 质谱分析 | 纳升液相色谱-串联质谱 | Creative Proteomics Inc. | -- |
| 病毒包装 | pMD2.G包装质粒 | -- | -- |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| CRISPR筛选 | EnAsCas12a cDNA质粒 | Addgene | 136476 |
| CRISPR敲除 | P3电转缓冲液 | Lonza | -- |
| 4D核转染仪 | Lonza | -- | |
| 胶原蛋白 | ThermoFisher | -- | |
| crRNA | -- | -- | |
| 位点突变 | 定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| 瞬时转染 | 靶向FOXA2的siRNA | Dharmacon | M-010089-01-0005 |
| 对照siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | |
| CUT&RUN | H3K4me3抗体 | Epicypher | 13-0041 |
| H3K27me3抗体 | Invitrogen | MA511198 | |
| H3K27ac抗体 | Epicypher | 13-0045 | |
| CUT&RUN试剂盒 | Epicypher | -- | |
| RNA-Seq | QIAGEN RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green PCR预混液 | Bio-Rad | -- |
| Bio-Rad qPCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 动物实验 | NSG雄性小鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PROX1表观遗传去抑制验证 | H3K27me3 CUT&Tag和RNA-Seq样本的获取及处理细节；EZH2敲除或抑制的模型；dTAGv-1处理浓度和时间 阅读提示：Methods: 'Data from clinical samples'、'Cell culture and reagents'；Figure 1 legend |
| CRISPR筛选和功能验证 | CRISPR筛选的文库、感染复数、天数；PROX1敲除的sgRNA序列；体内植入的细胞数、鼠龄和处理条件 阅读提示：Methods: 'For CRISPR screening'、'For PROX1 CRISPR knockout'、'Animal studies'；Figure 2 legend |
| PROX1过表达对PRAD肿瘤生长和转移的影响 | 过表达载体构建信息；体内植入的细胞数、鼠龄和处理条件；评估转移的方法和标准 阅读提示：Methods: 'For PROX1 overexpression'、'Animal studies'；Figure 2 legend |
| 转录组和CUT&RUN分析 | RNA-Seq文库构建和测序平台；CUT&RUN使用的抗体和剂量；差异表达分析方法和阈值 阅读提示：Methods: 'Epigenetic and transcriptomic studies'；Figure 3 legend |
| PROX1磷酸化鉴定和上游激酶预测 | 免疫沉淀的细节、质谱平台；点突变的具体方法；药物抑制剂的浓度和处理时间 阅读提示：Methods: 'Co-immunoprecipitation and mass spectrometry'、'Mutants of PROX1'、'Cell viability assays'；Figure 4 legend |