确定棕榈酰化参与舒尼替尼敏感性
初步探究棕榈酰化是否调节ccRCC细胞对舒尼替尼的敏感性
使用棕榈酰化抑制剂2-BP处理ccRCC细胞，检测细胞增殖和舒尼替尼IC50。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ZDHHC2介导的AGK棕榈酰化激活AKT-mTOR信号以降低肾细胞癌对舒尼替尼的敏感性
ZDHHC2-Mediated AGK Palmitoylation Activates AKT-mTOR Signaling to Reduce Sunitinib Sensitivity in Renal Cell Carcinoma
实验完整度
高包含细胞实验（CCK-8、凋亡、血管生成）、动物异种移植模型、患者组织样本、转录组分析和机制验证（棕榈酰化、质膜定位、突变回补）。
主要模型
786-O细胞系 A498细胞系 786-O舒尼替尼耐药细胞系（786-O R） BALB/c裸鼠异种移植模型
重点核对
ZDHHC2敲除或过表达对786-O、A498细胞舒尼替尼IC50的影响 ZDHHC2酶活突变体（C129A）对舒尼替尼敏感性的影响 AGK C72S突变对AGK棕榈酰化、质膜定位及AKT-mTOR通路的影响 ZDHHC2与AGK的蛋白相互作用（Co-IP、免疫荧光、GST-pull down） 体内实验中舒尼替尼给药方案（25 mg/kg，口服，每日一次，共8天）
摘要
能够抑制VEGF信号通路和血管生成的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）已被开发用于阻止恶性肿瘤的进展，并已被批准作为透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的一线靶向药物。脂质代谢失调是肾癌TKI耐药的主要驱动因素。在本研究中，我们证明了棕榈酰酰基转移酶ZDHHC2在对TKI（如舒尼替尼）耐药的组织和细胞系中异常上调。ZDHHC2的上调导致细胞和小鼠对舒尼替尼耐药，且ZDHHC2调节ccRCC中的血管生成和细胞增殖。机制上，ZDHHC2介导AGK的S-棕榈酰化，促进AGK转位至质膜并激活ccRCC中的PI3K-AKT-mTOR信号通路，从而调节舒尼替尼敏感性。总之，这些结果鉴定了一个ZDHHC2-AGK信号轴，并提示ZDHHC2是提高舒尼替尼在ccRCC中抗肿瘤疗效的可靶向候选分子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白棕榈酰化是否参与ccRCC对TKI（如舒尼替尼）的耐药过程，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- ZDHHC2通过其酶活性催化AGK Cys72位点的S-棕榈酰化，促进AGK在质膜上的定位，进而激活PI3K-AKT-mTOR信号通路，导致ccRCC对舒尼替尼耐药。
- 主要证据
- 在多株ccRCC细胞及异种移植模型中，ZDHHC2敲低或过表达改变舒尼替尼敏感性；ABE和Click-iT实验证明ZDHHC2介导AGK棕榈酰化；AGK C72S突变体减少质膜定位并降低AKT-mTOR磷酸化。
- 研究意义
- 鉴定ZDHHC2-AGK信号轴，提示ZDHHC2是提高舒尼替尼在ccRCC中抗肿瘤疗效的可靶向候选分子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选参与舒尼替尼敏感性的棕榈酰转移酶
鉴定在ccRCC中对舒尼替尼耐药有贡献的特异性PAT
利用CRISPR/Cas9系统在786-O细胞中逐一敲除24个ZDHHC成员，测量舒尼替尼IC50变化。
验证ZDHHC2对舒尼替尼敏感性的功能
验证ZDHHC2是否影响ccRCC体内外对舒尼替尼的敏感性
在ccRCC细胞中敲低或过表达ZDHHC2，评估细胞增殖、凋亡和异种移植肿瘤生长。
评估ZDHHC2对ccRCC增殖和血管生成的作用
探索ZDHHC2在ccRCC肿瘤进展中的功能，如增殖和血管生成
通过CCK-8、HUVEC管形成实验和Western blot检测增殖、血管生成相关指标。
验证ZDHHC2激活AKT-mTOR信号通路
探究ZDHHC2调控舒尼替尼敏感性的信号通路
通过转录组测序和Western blot检测AKT和S6K1磷酸化水平，并在组织芯片中分析相关性。
测试mTOR抑制剂依维莫司对ZDHHC2诱导耐药的影响
评估抑制AKT-mTOR通路能否逆转ZDHHC2诱导的舒尼替尼耐药
在ZDHHC2变化背景下联合依维莫司处理，检测血管生成、VEGFA表达和舒尼替尼IC50。
鉴定ZDHHC2相互作用蛋白
寻找ZDHHC2激活AKT-mTOR通路的中介蛋白
通过免疫沉淀-质谱分析鉴定ZDHHC2结合蛋白，并用Co-IP、免疫荧光和GST-pull down验证。
验证AGK参与ZDHHC2诱导的舒尼替尼耐药
确认AGK是否介导ZDHHC2对舒尼替尼敏感性的调节
通过敲低或过表达AGK及其突变体，检测舒尼替尼IC50、细胞增殖和体内肿瘤生长。
检测AGK的棕榈酰化修饰
验证AGK是否被ZDHHC2棕榈酰化
使用ABE和Click-iT法检测AGK棕榈酰化水平，并通过突变预测位点确定棕榈酰化位点。
探究棕榈酰化对AGK质膜定位和信号通路的影响
确定AGK棕榈酰化对质膜定位及AKT-mTOR信号活化的影响
通过亚细胞分级和免疫荧光观察AGK质膜定位，检测AKT和S6K1磷酸化及舒尼替尼IC50。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
基因编辑
蛋白互作分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Gibco | -- |
| MEM培养基 | Procell Life Science & Technology | PM150410 | |
| 胎牛血清 | Shanghai Life-iLab Biotech | AC03L055 | |
| 支原体检测 | 支原体检测试剂盒 | InvivoGen | rep-pt1 |
| 细胞培养 | 支原体清除试剂 | InvivoGen | ant-mpp |
| Western blot | β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| ZDHHC2抗体 | Affinity Bioscience | DF4688 | |
| AGK抗体 | Abcam | ab137616 | |
| pAKT S473抗体 | Cell Signaling Technology | #4060S | |
| pAKT T308抗体 | Cell Signaling Technology | 13038 | |
| pS6K1 T389抗体 | Cell Signaling Technology | 9209 | |
| 药物处理 | 舒尼替尼 | Selleckchem | S7781 |
| 依维莫司 | Selleckchem | S1120 | |
| 替沃扎尼 | Selleckchem | S1207 | |
| 2-溴十六烷酸 | Selleckchem | E0120 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| PVDF膜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Protein A+G磁珠 | Beyotime | P2029 | |
| 免疫球蛋白G | Beyotime | A7007 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Prime Script逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| TB Green快速qPCR混合液 | Takara | -- | |
| 免疫组化 | 组织芯片 | Bioaitech | U081ki01 |
| 凋亡检测 | Caspase-3活性检测试剂盒 | Abcam | ab39401 |
| Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Procell | -- | |
| 血管生成实验 | 基质胶 | -- | -- |
| GST pull-down | BeyoMag抗GST磁珠 | Beyotime | P2138 |
| 谷胱甘肽-琼脂糖微珠 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| HisSep Ni-NTA磁珠 | Yeasen | 20561ES03 | |
| 质膜蛋白提取 | 质膜蛋白提取试剂盒 | Abcam | ab65400 |
| ABE assay | 甲基甲烷硫代磺酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 羟胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 生物素- HPDP | Top Science | -- | |
| Click-iT | Click-iT棕榈酸叠氮化物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Click-iT蛋白质反应缓冲液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10276 | |
| 体外棕榈酰化实验 | 棕榈酰炔基辅酶A | Cayman | 15968 |
| Palmostatin B | Sigma | 178501 | |
| 免疫荧光 | DiD（远红质膜荧光探针） | Beyotime | C1039 |
| CRISPR/Cas9 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和培养 | 786-O、A498、ACHN细胞来源及STR鉴定结果；786-O R细胞的诱导方案 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines, antibodies, and chemicals |
| ZDHHC2功能实验 | ZDHHC2 siRNA/sgRNA序列及转染条件；puromycin筛选浓度和时间；舒尼替尼处理浓度和时间 阅读提示：Results: Figure 1 legend; Materials and Methods: Cell culture, Transient transfection |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系、周龄、体重；接种细胞数和部位；舒尼替尼给药剂量、方式、频率和持续时间 阅读提示：Materials and Methods: Mouse xenograft assay; Results: Figure 1 legend |
| 蛋白质棕榈酰化检测 | ABE实验中甲基甲烷硫代磺酸酯和羟胺浓度；Click-iT实验中棕榈酸-叠氮化物浓度和处理时间；生物素-HPDP使用条件 阅读提示：Materials and Methods: Acyl-biotinyl exchange assay, Click-iT pull down |
| 质膜定位分析 | 质膜蛋白提取试剂盒的操作步骤和离心条件；细胞裂解量 阅读提示：Materials and Methods: PM protein extraction and subcellular fractionation assay |
| 统计分析 | 每组样本量（n）；统计方法（t检验或ANOVA）；显著性阈值 阅读提示：Materials and Methods: Statistical analysis; 各图注 |