体外细胞系半胱氨酸从头合成能力评估
检测培养的多种癌细胞系（SCLC、NSCLC、PDAC、HCC）是否能通过转硫途径从丝氨酸合成半胱氨酸
使用13C3-丝氨酸孵育细胞4小时，检测丝氨酸、胱硫醚和半胱氨酸的标记分数；并用免疫印迹检测CBS和CSE表达。
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综合代谢示踪揭示哺乳动物组织和肿瘤中半胱氨酸的来源与分解代谢
Comprehensive Metabolic Tracing Reveals the Origin and Catabolism of Cysteine in Mammalian Tissues and Tumors
实验完整度
高包含体外细胞系示踪、体内多种组织及GEMM肿瘤示踪、免疫印迹、细胞活力实验等多层级验证，且进行功能验证（CSE抑制、回补实验）和机制探索。
主要模型
健康C57BL/6J小鼠（九种组织） Myc; p53−/−小鼠肝癌模型 LSL-KrasG12D; Trp53flox; p48-Cre小鼠胰腺导管腺癌模型 KrasG12D; p53−/− LUAD和Rb1−/−; p53−/−; MycT58A SCLC小鼠模型
重点核对
小鼠品系及肿瘤模型（C57BL/6J、KPC、KP/KPN、RPM(RPMM)） 稳定同位素示踪剂：1-[13C1]-丝氨酸和13C6-胱氨酸的输注浓度（20 mg/mL和10 mg/mL）及输注时间（4小时） 组织采集：9种正常组织（肝、胰、肾、心、胸腺、脾、肺、小脑、脑） 细胞系培养条件：如NSCLC细胞系在无胱氨酸培养基中的处理（0或200 μmol/L胱氨酸，1 mmol/L高半胱氨酸/胱硫醚，100 μmol/L PPG） LC/MS分析参数：如使用Q Exactive HF质谱仪，扫描范围m/z 65-950，分辨率120,000
摘要
半胱氨酸在细胞生物合成、酶催化和氧化还原代谢中发挥关键作用。细胞内半胱氨酸库可通过胱氨酸摄取或由丝氨酸和高半胱氨酸从头合成来维持。在肿瘤发生过程中，对半胱氨酸的需求增加，以生成谷胱甘肽来应对氧化应激。虽然已显示培养细胞高度依赖外源性胱氨酸来增殖和存活，但不同组织在体内如何获取和使用半胱氨酸尚未得到表征。我们使用稳定同位素13C1-丝氨酸和13C6-胱氨酸示踪，全面探究了正常小鼠组织及其来源癌症中的半胱氨酸代谢。从头半胱氨酸合成在正常肝脏和胰腺中最高，在肺组织中缺失，而肿瘤发生过程中半胱氨酸合成要么失活要么下调。相比之下，胱氨酸摄取及其向下游代谢物的代谢是正常组织和肿瘤的普遍特征。然而，不同肿瘤类型之间来自半胱氨酸的谷胱甘肽标记存在明显差异。因此，胱氨酸是肿瘤半胱氨酸库的主要贡献者，且谷胱甘肽代谢在不同肿瘤类型中活性不同。意义：稳定同位素13C1-丝氨酸和13C6-胱氨酸示踪表征了正常小鼠组织中的半胱氨酸代谢及其在肿瘤中的重编程，使用肝、胰和肺癌的基因工程小鼠模型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在体内，不同组织和肿瘤如何获取半胱氨酸？从头合成和外源性胱氨酸摄取分别贡献多少？半胱氨酸向下游代谢物（如谷胱甘肽、牛磺酸）的代谢有何差异？
- 核心机制
- 肿瘤发生过程中，从头半胱氨酸合成（转硫途径）在肝、胰腺肿瘤中下调或缺失，在肺肿瘤中缺失；而胱氨酸摄取是肿瘤半胱氨酸库的主要来源，且不同肿瘤中谷胱甘肽合成活性差异由GCL、xCT表达及底物可用性调控。
- 主要证据
- 使用稳定同位素13C1-丝氨酸和13C6-胱氨酸在小鼠体内输注，结合LC/MS检测标记，发现肝脏和胰腺中从头合成较高，而肝、胰腺肿瘤中下调，肺肿瘤中缺失；所有肿瘤均显示胱氨酸标记，但谷胱甘肽标记在不同肿瘤中不同。
- 研究意义
- 该研究揭示了肿瘤中半胱氨酸代谢的异质性，提示胱氨酸是肿瘤半胱氨酸的主要来源，可能为针对半胱氨酸代谢的癌症治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NSCLC细胞转硫途径底物限制验证
探讨转硫途径是否受底物（高半胱氨酸/胱硫醚）限制，以及外源添加能否在胱氨酸缺乏时维持细胞活力
在胱氨酸缺乏培养基中，向NSCLC细胞添加高半胱氨酸或胱硫醚，并联合CSE抑制剂PPG处理，检测细胞活力；同时进行13C3-丝氨酸示踪检测代谢物标记。
健康小鼠组织从头半胱氨酸合成谱
评估不同健康组织中转硫途径对半胱氨酸库的贡献
通过颈静脉插管对C57BL/6J小鼠输注1-[13C1]-丝氨酸4小时，收集9种组织（肝、胰、肾、心、胸腺、脾、肺、小脑、脑）和血清，LC/MS检测丝氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、谷胱甘肽等标记；同时免疫印迹检测CBS和CSE表达。
健康小鼠组织胱氨酸摄取及下游代谢
评估外源性胱氨酸对各组织半胱氨酸库及其下游代谢物（谷胱甘肽、亚牛磺酸）的贡献
输注13C6-胱氨酸4小时，检测组织中胱氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、亚牛磺酸的标记；免疫印迹检测xCT、CDO1、CSAD、ADO、FMO1、GCLC、GCLM、GSS表达。
肝和胰腺肿瘤中从头合成的重编程
检测肿瘤发生是否改变转硫途径活性
使用GEMM模型（Myc; p53−/− HCC和KPC PDAC），输注1-[13C1]-丝氨酸，比较正常组织与肿瘤中丝氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、谷胱甘肽等的标记；免疫印迹检测CBS、CSE表达；并查询TCGA/GTEx中人类肿瘤中CBS mRNA表达。
肺肿瘤中从头合成能力评估
检测肺肿瘤是否获得转硫途径能力
使用LUAD（KP和KPN）和SCLC（RPM/RPMM）GEMM，输注1-[13C1]-丝氨酸，比较正常肺与肿瘤的标记；免疫印迹检测CBS、CSE表达；查询TCGA/GTEx中人类肺肿瘤中CBS、CSE mRNA表达。
肿瘤中胱氨酸摄取及谷胱甘肽代谢分析
评估胱氨酸对肿瘤半胱氨酸库的贡献及谷胱甘肽合成活性
向HCC、PDAC、LUAD GEMM及正常对照输注13C6-胱氨酸，检测肿瘤中半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽标记；免疫印迹检测xCT、GCLC、GCLM、GSS表达；查询TCGA/GTEx中相关基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与代谢标记 | RPMI1640培养基（不含L-谷氨酰胺、氨基酸、葡萄糖，粉末） | US Biological | R9010-01 |
| DMEM培养基（含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，不含葡萄糖、丝氨酸、甘氨酸，粉末） | US Biological | D9800-16 | |
| 细胞培养 | 透析胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F0392 |
| 细胞培养与代谢标记 | 13C3-丝氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1574-H-0.1 |
| 1-13C1-丝氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1573-0.25 | |
| 13C3-半胱氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-4320-H-PK | |
| 代谢物提取 | 甲醇（LC/MS级） | Thermo Fisher Scientific | 047192.M1 |
| N-乙基马来酰亚胺 | Alfa Aesar | 40526-06 | |
| 甲酸铵 | Frontier Scientific | JK967458 | |
| 细胞活力实验 | DL-炔丙基甘氨酸 | Fisher Scientific | 437320010 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris中号凝胶 | Invitrogen | -- | |
| 硝酸纤维素转印膜 | Cytiva | -- | |
| ADO（兔多克隆抗体） | OriGene | TA322128 | |
| CBS（D8F2P；兔单克隆抗体） | Cell Signaling Technology | 14782 | |
| CDO1（兔多克隆抗体） | Proteintech | 12589-1-AP | |
| CSAD（兔多克隆抗体） | LSBio (LifeSpan) | LS-C375526 | |
| CSE（兔多克隆抗体） | Proteintech | 12217-1-AP | |
| FMO1（兔多克隆抗体） | LSBio (LifeSpan) | LS-C346135-50 | |
| GCLC（小鼠单克隆抗体） | Santa Cruz Biotechnology | sc-390811 | |
| GCLM（兔多克隆抗体） | GeneTex | GTX114075 | |
| HSP90（兔多克隆抗体） | Cell Signaling Technology | 4874 | |
| xCT（兔多克隆抗体） | Cell Signaling Technology | 98051 | |
| LC/MS分析 | Q Exactive HF (QE-HF) Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SeQuant ZIC-pHILIC色谱柱 | MilliporeSigma | -- | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC VanGuard FIT色谱柱 | Waters | -- | |
| 动物实验 | Ad5CMVCre腺病毒 | University of Iowa | -- |
| Ad5CGRPCre腺病毒 | University of Iowa | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与标记条件 | 细胞系来源和培养条件：培养基类型（RPMI1640或DMEM）、血清类型（FBS或dFBS）、标记物浓度（13C3-丝氨酸 300或400 μmol/L）、标记时间（4小时） 阅读提示：Materials and Methods中的Cell lines和Stable isotope labeling in cell culture部分 |
| 动物模型与同位素输注 | 小鼠品系和肿瘤模型：HCC (Myc; p53−/−)，PDAC (KPC)，LUAD (KP/KPN)，SCLC (RPM/RPMM)；输注物和浓度：1-[13C1]-丝氨酸（20 mg/mL）、13C6-胱氨酸（10 mg/mL）；输注速率（120 μL/h）和时间（4小时） 阅读提示：Materials and Methods中的Generation of experimental animals和Stable isotope animal infusions部分 |
| 代谢物提取与LC/MS分析 | 提取溶剂成分（80%甲醇/20%水，含10 mmol/L甲酸铵和25 mmol/L NEM，pH 7.0）、色谱柱型号、质谱参数（Q Exactive HF，扫描范围m/z 65-950，分辨率120,000） 阅读提示：Materials and Methods中的Metabolomics sample preparation和LC/MS analysis and data processing部分 |
| 免疫印迹条件 | 抗体稀释度（1:1000）、蛋白转移膜类型（0.45 μm硝酸纤维素膜）、封闭条件（5%脱脂牛奶） 阅读提示：Materials and Methods中的Immunoblotting部分 |
| 统计与数据分析 | 统计方法：Mann-Whitney检验；软件：GraphPad Prism 9；同位素校正：IsoCor 阅读提示：Materials and Methods中的Quantification and statistical analysis部分 |