模型建立
构建模拟肿瘤发生不同阶段的细胞模型
用pBabe-hygro-hTERT、pBabe-zeo-SV40和pBabe-puro-HrasV12依次感染早期传代BJ成纤维细胞，产生EP、hTERT、SV40和HRAS四个阶段。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
致癌转化驱动转座子位点的DNA甲基化丢失和转录激活
Oncogenic Transformation Drives DNA Methylation Loss and Transcriptional Activation at Transposable Element Loci
实验完整度
高包含体外细胞模型（Weinberg转化模型）的多阶段分析，结合RNA-seq、WGBS、qPCR、Western blot及TCGA数据验证，涵盖表达、甲基化及蛋白水平验证。
主要模型
BJ成纤维细胞（Weinberg转化模型） TCGA乳腺癌、结肠癌、前列腺癌数据集
重点核对
细胞模型：早期传代BJ成纤维细胞依次转导hTERT、SV40、HRAS（三个生物学重复） 测序深度：RNA-seq平均9600万reads，WGBS 8-10X覆盖 TE表达分析：TEtranscripts（亚家族水平）和Telescope（位点特异性） 差异甲基化分析：DSS软件识别DMRs qPCR验证：LTR26、LTR25、L1FLnI_1q25.1e
摘要
转座元件（TEs）在分化的健康人体组织中通常被DNA甲基化和抑制性组蛋白修饰所沉默。然而，TE表达在多种癌症中增加，并与癌症基因组的整体低甲基化相关。我们评估了连续转导hTERT、SV40和HRASR24C以永生化并转化的人类成纤维细胞中TE的表达和DNA甲基化，该模型模拟了肿瘤发生的不同步骤。在转化的每个阶段进行了RNA测序和全基因组亚硫酸氢盐测序。随着细胞转化的进展，TE表达显著增加，在转化的最后阶段表达增加最大，与人类肿瘤的数据一致。上调的TE以内源性逆转录病毒（LTR）为主。所有阶段的大多数差异甲基化区域（DMR）都是低甲基化的，在转化的最后阶段低甲基化最严重。大多数DMR与RepeatMasker数据库中的TE重叠，表明TE优先被去甲基化。许多低甲基化的TE表现出一致的表达增加。去甲基化在永生化期间开始并持续到转化，而TE转录的上调发生在转化期间。该模型中上调的许多LTR元件也在乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的TCGA数据集中被识别。总的来说，这些发现表明转座元件，特别是内源性逆转录病毒，在转化过程中被去甲基化和转录。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在癌症进展过程中，特定TE位点的转录和甲基化变化如何，以及低甲基化是否直接与TE表达增加相关。
- 核心机制
- 致癌转化导致TE（尤其是内源性逆转录病毒）的DNA甲基化丢失，进而引起转录激活，且低甲基化与表达增加相关。
- 主要证据
- Weinberg转化模型中RNA-seq和WGBS数据显示TE表达增加和低甲基化，qPCR和Western blot验证，TCGA数据交叉验证。
- 研究意义
- 揭示了TE去甲基化和转录在转化中的全基因组图谱，暗示TE表达可作为癌症早期检测的生物标志物和免疫治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
评估各阶段TE的表达变化
提取RNA，去除rRNA，构建TruSeq链特异性RNA文库，进行2x150bp双端测序，使用TEtranscripts和Telescope分析TE表达。
甲基化分析
评估各阶段TE的DNA甲基化变化
提取DNA，进行亚硫酸氢盐转化，构建WGBS文库，进行全基因组测序，使用Bismark比对，DSS识别DMR。
关联分析
确定TE低甲基化与表达增加的关联
比较DMR重叠的TE和TE表达变化，分析亚家族和位点水平的相关性。
验证实验
验证RNA-seq和甲基化结果
通过qPCR验证LTR26和L1FLnI_1q25.1e的表达；通过Western blot验证DNMT1、H3K9me、ERV3、Syncytin-1蛋白。
TCGA交叉验证
验证模型中的ERV在人类肿瘤中的表达
将模型中上调的ERV与TCGA乳腺癌、结肠癌、前列腺癌的差异表达ERV比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | KO DMEM培养基 | -- | -- |
| Medium 199培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| pBabe-hygro-hTERT质粒 | Addgene | RRID:Addgene_1773 | |
| pBabe-zeo-SV40大T基因组DNA | Addgene | RRID:Addgene_1778 | |
| pBabe-puro-HrasV12质粒 | Addgene | RRID:Addgene_1768 | |
| 细胞计数 | Invitrogen自动细胞计数器 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Scientific | 15596026 |
| RNA-seq文库制备 | Ribozero rRNA去除试剂 | Illumina | -- |
| TruSeq链特异性总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | P/N 20020596 | |
| 定制10 bp UDI TruSeq兼容双链Y接头 | IDT | IDT10_UDI_1 through IDT10_UDI_15 | |
| RNA-seq测序 | Illumina NovaSeq S4测序仪 | Illumina | -- |
| 亚硫酸氢盐转化 | Zymo EZ DNA甲基化快速试剂盒 | Zymo | Catalog # D5030 |
| WGBS文库制备 | Swift Accel-NGS甲基化测序DNA文库制备试剂盒 | Swift | Catalog # 30024 |
| WGBS测序 | Illumina HiSeq-10X测序仪 | Illumina | -- |
| qPCR | SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- |
| QuantStudio热循环仪 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green qPCR引物 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Pierce | 89900 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Pierce | A32961 | |
| Bioruptor超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| NuPAGE LDS 4x上样缓冲液 | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE 10x还原剂 | Invitrogen | NP0009 | |
| 4-20%预制胶 | BioRad | 4561093 | |
| 低荧光PVDF膜 | BioRad | 170-4274 | |
| Odyssey封闭液 | LI-COR Biosciences | 927-40100 | |
| hTERT抗体 | Thermo Scientific | PA5-11446 | |
| SV40抗体 | Santa Cruz | sc-147 | |
| HRAS抗体 | Proteintech | 18295-1-AP | |
| ERV3抗体 | mybiosource | MBS178214 | |
| LINE-1-ORF1p抗体 | Millipore Sigma Aldrich | MABC1152 | |
| SYN-1抗体 | Abcam | 71115 | |
| DNMT1抗体 | Sigma-Aldrich | D4692 | |
| H3K9抗体 | Abcam | ab176916 | |
| H3抗体 | Cell Signaling Technology | 3638T | |
| β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970L | |
| Azure Biosystems c600成像系统 | Azure Biosystems | -- | |
| Image Studio软件 | LI-COR Biosciences | -- | |
| AzureSpectra700二抗 | Azure | AC2128, AC2129 | |
| AzureSpectra800二抗 | Azure | AC2135, AC2134 | |
| RNA提取 | MaXtract高密度相分离管 | Qiagen | 129056 |
| RNA处理 | DNase | Thermo Scientific | EN0525 |
| cDNA合成 | High Capacity cDNA合成试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型建立 | 细胞系：BJ成纤维细胞；转导顺序：hTERT、SV40、HRAS；筛选药物浓度：潮霉素80 μg/ml、zeocin 800 μg/ml、嘌呤霉素1 μg/ml；处理时间：3-5天；生物学重复数：3。 阅读提示：Materials and Methods: Cell Lines (Weinberg Transformation Model) |
| RNA-seq | RNA提取方法：Trizol；rRNA去除：Ribozero；文库制备试剂盒：TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit；测序平台：NovaSeq S4；读长：2x150bp；目标深度：每样本1亿reads。 阅读提示：Materials and Methods: RNA-seq Library Preparation |
| WGBS | DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒：Zymo EZ DNA Methylation-Lightning Kit；文库制备试剂盒：Swift Accel-NGS Methyl-Seq DNA Library Kit；测序平台：HiSeq-10X；读长：PE150；覆盖度：8-10X。 阅读提示：Materials and Methods: Bisulfite Conversion and WGBS Sequencing Library Preparation |
| TE表达分析 | TEtranscripts版本2.2.1；Telescope版本（conda环境依赖）；比对软件STAR版本2.7.7a；参考基因组hg38。 阅读提示：Materials and Methods: TE analyses, RNA-seq QC and Alignment |
| 差异甲基化分析 | 比对软件：Bismark v0.23.0；去重：deduplicate_bismark；提取：bismark_methylation_extractor；差异甲基化分析：DSS。 阅读提示：Materials and Methods: Whole Genome Bisulfite Sequencing Analysis |
| qPCR验证 | RNA提取：Trizol；DNA酶处理：Thermo Scientific EN0525；cDNA合成：High Capacity cDNA Kit；qPCR试剂：SYBR Green Master Mix；引物序列：见方法。 阅读提示：Materials and Methods: qPCR |
| Western blot验证 | 裂解液：RIPA缓冲液；蛋白酶/磷酸酶抑制剂；抗体信息及稀释比例：见方法。 阅读提示：Materials and Methods: Western Blot |